[发明专利]光谱学测定在脂立方样品中膜蛋白稳定性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质基因工程技术领域，具体涉及一种通过光谱学测定脂立方样品中的膜蛋白的活性以和稳定性的方法。

背景技术

早在1960年研究者就已经证明，亲水性和疏水性的两性分子在水中可以形成很多形态各异结构的理论。1962年luzzati的研究组测定了层状相的结构，也获得了六角相的电子显微结构。随后不久，又用X射线技术测定了类脂立方相的结构。1968年luzzati与加拿大的研究专家对脂质-水体系（lipid-water system）进行了X射线的研究，得到了脂质-水体系的随脂质浓度和温度变化的部分相图。1980年larsson提出，立方液晶中无限循环排列的脂双层膜非常类似于生物膜中的脂双层膜。1990年Engbrom S.及其同事根据脂质立方液晶的结构特点，提出可以将类脂立方液晶用作药物载体。脂质立方相 (Lipidic cubic phase, LCP) 应用于膜蛋白结晶最早是在1996年，Landau & Rosenbusch通过脂质立方相获得了第一个完整的细菌视紫红质蛋白的2.5埃的晶体结构。在此之后，通过脂质立方相结晶膜蛋白就成为一个很实用的技术，并被广泛传播。实践证明，这项技术对于阐明膜蛋白的结构机制是至关重要的，近年来，通过LCP获得了很多关键蛋白的结构信息，譬如，各种细菌视紫红质蛋白以及第一个高分辨率的人源G蛋白偶联受体（2-adrenergic receptor）。 运用脂质立方相能成功获得高分辨率膜蛋白晶体，主要归结为以下两个原因：第一，与使用去垢剂与蛋白形成微球的恶劣环境不同，脂质立方相提供了一个更加接近天然的类似生物膜的环境；第二，在脂质立方相中，晶体生长时蛋白分子是按照I型堆积方式堆积，也就是蛋白分子不仅通过亲水部位相互作用堆积，也通过疏水部位相互接触而堆积，从而使得晶体结构更加有序，所含的水更少。到目前为止，通过LCP获得的晶体结构达102个，蛋白种类达22种，晶型27种。因此，我们可以看出LCP为结构生物学研究提供了一个强有力的工具，在未来膜蛋白结构生物学研究中将扮演着举足轻重的角色。

在获得更多的蛋白结晶并解析其结构的基础上，我们可以来进行基于蛋白结构的药物设计，从而更加有效快速的筛选潜在药物，减少药物研发的成本和周期，并且可以有效的提高药物的疗效和减少药物的副作用。热稳定性越高的蛋白，其相应结晶成功率也就越高。因此为了更好的用脂立方技术进行蛋白结晶实验，筛选有前景的蛋白construct又是其中的重中之重。另外，脂立方主要的脂质和脂质添加剂，以及限定可能的沉淀剂和缓冲液的范围，都有可能影响蛋白的热稳定性。 

现有技术中，蛋白的热稳定性测定办法非常多，包括底物结合曲线，圆二色光谱，升温曲线等等。然而这些技术都是基于蛋白在溶液中的情况，并不反映蛋白在脂立方样品中的具体表现。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种方法设计合理、可操作性强、可以在脂立方样品内直接测定膜蛋白的稳定性的方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种光谱学测定在脂立方样品中膜蛋白稳定性的方法，其特点是，其步骤如下：

（1）表达和纯化目标蛋白；在NCBI网站上输入目标膜蛋白名称搜索序列，得到目标膜蛋白的全长基因序列；将全长序列导入相关细胞表达系统，然后进行纯化，得到纯化后的膜蛋白溶液；

（2）将膜蛋白溶液混入脂立方样品；

①将纯甘油一油酸酯或者甘油一油酸酯与下述脂类分子中的一种组成的混合物从-20℃的冰箱取出中，加热至37-40℃后形成液态；前述脂类分子选自1,2 - 二油酰-sn-甘油-3 - 磷酸胆碱，1,2-二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺，1,2-二油酰-sn-甘油基-3 - 磷脂酰甘油，1,2-二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰丝氨酸或者胆固醇；其中，纯甘油一油酸酯占混合物质量的90%以上；

②将液态甘油一油酸酯或者混合物转移到玻璃针管中冷却至20-24℃，并立即与膜蛋白溶液混合得到膜蛋白溶液样品，将膜蛋白溶液样品推过注射器的连接器以形成均匀的脂立方样品；脂立方样品中膜蛋白的最终浓度为0.5-2.0毫克/毫升，脂立方样品中水的重量百分比为38-42％；同时以不含前述膜蛋白的缓冲液作对照；

③当一个均匀和透明的脂立方样品形成后，将50-70微升的脂立方样品转移到石英比色皿中，密封；在5600×g和18-22℃的条件下离心；

（3）膜蛋白在脂立方样品中的稳定性测定；