[发明专利]一种淋病奈瑟菌的转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学微生物学领域，具体涉及一种淋病奈瑟菌的转化方法。

背景技术

淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae，NG)感染泌尿生殖系统引起淋病，此病是一种常见的性传播疾病(Sexual Transmitted Disease,STD)。近年来淋病发病率居我国性传播疾病首位，危害十分严重。淋病奈瑟菌经性行为传播，多侵袭泌尿生殖道黏膜，主要引起男性尿道炎、前列腺炎和女性盆腔炎、子宫内膜炎等。由于淋病奈瑟菌耐药性现象的日趋严重，淋病的治疗也出现了新的难题。因此，对淋病奈瑟菌感染机制及疫苗的研究成为预防和控制淋病流行传播的重要措施。淋病奈瑟菌(NG)生长较慢，对培养基的营养要求非常高，常用巧克力（色）血琼脂培养基，需要在5%CO₂环境下才能生长良好。普通转化需要新鲜的液体培养物且不易转化成功。目前尚缺少适宜淋病奈瑟菌的转化方法从而实现外源基因的表达，这在很大程度上限制了对淋病奈瑟菌的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种适合淋病奈瑟菌的转化方法，其中包括制备适宜转化用的淋病奈瑟菌感受态，探索淋病奈瑟菌的转化条件，实现外源基因在淋病奈瑟菌中的表达。

本发明所使用的技术方案是：淋病奈瑟菌分别经液体及固体培养基培养后，收集细菌于离心管中，细菌经洗涤悬浮后制得淋病奈瑟菌感受态作为转化用受体菌备用；通过电转化方法将原核表达载体pet1-EGFP转入备用的淋病奈瑟菌中，用酶切和PCR方法筛选鉴定重组淋病奈瑟菌（rNG）；荧光显微镜观察rNG外源蛋白的表达情况。rNG经固体培养基多次传代及冻存3、6、9、12月后对其稳定性进行评价。构建的rNG为进一步研究淋病奈瑟菌的感染免疫机制奠定了基础。

本发明中淋病奈瑟菌培养时，先液体培养，后转为固体培养，细菌培养到对数生长期。

上述方法中，制备淋病奈瑟菌感受态是冰浴静置后用超纯水洗涤。

上述方法中所述的转化为电转化，细菌经孵育后直接转化，培养后再涂板。

上述原核表达载体pet1-EGFP，其结构是在质粒pet-30a的BamHI和HindII双酶切位点插入EGFP序列。

本发明通过优化淋病奈瑟菌的培养条件，制备了淋病奈瑟菌感受态，建立了淋病奈瑟菌的转化方法，此转化方法简便易行，获得的重组菌性质稳定，为今后淋病奈瑟菌感染机制和疫苗效果的研究奠定了基础。同时，该转化方法的建立进一步拓宽了淋病奈瑟菌的研究领域，因而具有广阔的市场前景。

附图说明

图1为荧光显微镜下观察到的表达EGFP的淋病奈瑟菌图像。

具体实施方式

1、电转化用淋病奈瑟菌感受态的制备

淋病奈瑟菌经液体及固体培养基【每升液体培养基含有哥伦比亚培养基基础（35g）,酵母抽提物（5g）,葡萄糖（5g）,新胨蛋白胨（2.5g）,氯化血红素（终浓度0.015‰），吐温-80（终浓度0.05%）,吡哆醛（终浓度0.006‰）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（终浓度0.015‰）；每升固体培养基在液体培养基的基础上加入琼脂粉（终浓度2%）】培养到对数生长期后（先液体培养，后转为固体培养），用0.01M PBS缓冲液轻轻洗下固体培养基上的细菌收集于离心管中置于冰浴中。细菌再经预冷的超纯水充分洗涤、悬浮，100μl分装后即用于电转化试验或冻存于-80℃备用。

2、电转化

转化用质粒pet1-EGFP的小量制备：根据EGFP序列设计引物，上下游引物序列为：cgggatccgtgagcaagggcgaggag（SEQ ID NO.1），cccaagcttcggccgctt tacttgtacag（SEQ ID NO.2）。引物中分别引入BamHI和HindIII酶切位点。以质粒pEGFP-N1(Clontech公司)为模板，PCR扩增EGFP，经TA克隆获得重组质粒T-EGFP。用BamHI和HindIII分别双酶切质粒T-EGFP和pet-30a(Novagen 公司)，将EGFP片段与pet-30a片段连接、转化获得重组质粒pet1-EGFP。

取2μl的小提质粒pet1-EGFP加入100μl淋病奈瑟菌感受态细胞中，混匀静置后进行电转化。设置电转化条件（电击参数设置为：1.2-1.8kV，25μF）。电转化结束后将细菌混合物置于37℃培养箱过夜培养，细菌培养物经离心后涂布于卡那霉素平板静置培养。取单个菌落扩增和提取质粒后用PCR和酶切筛选鉴定重组菌rNG。

3、外源蛋白表达