[发明专利]一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程中对植物进行遗传转化的方法，特别是涉及根癌农杆菌介导植物遗传转化的方法，具体是一种根癌农杆菌介导甘蔗品种川蔗23号遗传转化Bt抗虫基因的方法。

背景技术

甘蔗(Saccharum officinarum L.)是重要的糖能经济作物，在世界各地广泛栽植，其产糖量约占世界糖产量的60%～70%，在我国则占到90%以上。甘蔗大田生产的整个生长发育期内均会受到多种虫害威胁，尤以鳞翅目害虫——蔗螟（主要有条螟、二点螟、大螟、白螟、黄螟等）危害最大，以幼虫蛀入甘蔗幼苗和蔗茎，导致甘蔗商品性、糖份等品质下降，并带来每年20%～25%的损失。利用有性杂交技术培育抗虫甘蔗品种是提高甘蔗抗虫能力的重要途径。但是，甘蔗是高度杂合的异源多倍体和多倍的非整倍体植物，遗传背景十分复杂，利用传统育种方法从有性杂交到良种育成要10～13年，周期长成效低。基因工程可以定向改变作物的某些性状，为植物的育种开辟了新途径。

Bt（cry1Ab）基因是从微生物苏云金杆菌分离出的一种杀虫结晶蛋白基因，是一种广谱性的抗虫基因，它指导合成的杀虫结晶蛋白（ICP）。对许多鳞翅目、双翅目及鞘翅目的昆虫均有较强毒性。至1987年首次获得转Bt烟草植株以来，现已在许多植物的遗传转化中得以运用。

甘蔗的遗传转化研究首次报道始于1987年，目前成功培育出转基因甘蔗的转化方法有原生质体电穿孔法、基因枪法和农杆菌介导法等3种。农杆菌介导法简便、易于操作，克服了基因枪法及电击法等直接转化法转化效率低，转化体嵌合体多、转化外植体不易成活及拷贝数多的缺点，因此研究甘蔗农杆菌介导遗传转化对甘蔗遗传工程改良有重要的理论与实践意义。1998年，Arencibia等采用工程菌LBA4404和EHA101成功进行了农杆菌介导的甘蔗遗传转化，平均转化率为0.194%～1.115%，开辟了甘蔗农杆菌介导法转基因研究的先河。同年，Elliott使用工程菌株AGLO进行甘蔗转基因研究，转化效率为5.13%。此后国内外都相继开展了农杆菌介导的甘蔗遗传转化研究。国内有关甘蔗遗传转化的研究较晚，王自章等、罗敬萍等、于兰等、唐建平等先后通过根癌农杆菌介导法成功获得了甘蔗的转基因植株。

出乎预料的是，研究过程中发现按照现有技术中的甘蔗的遗传转化方法对自育甘蔗品种川蔗23号的进行遗传转化，几乎无法实现，而到目前为止还没有见到对特定的川蔗23号进行遗传转化的报道。本领域公知，影响农杆菌遗传转化甘蔗的因素很多，如甘蔗的基因型、受体材料类型、农杆菌株系、菌体浓度、乙酰丁香酮（AS）浓度、浸染时间、共培养时间等。经过长时间的研究发现，对于川蔗23号而言，菌体浓度与浸染时间是影响转化效率的关键因素。在较高菌液浓度与较长浸染时间的条件下可导致受体胚性愈伤组织在筛选培养基上因农杆菌过度增殖而污染死亡，其污染死亡率高达90%以上，从而进一步导致转化无法实现。本发明的方法大大降低了川蔗23号胚性愈伤组织的污染率并成功实现其遗传转化Bt抗虫基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种根癌农杆菌介导甘蔗品种川蔗23号遗传转化Bt抗虫基因的方法，可以显著降低川蔗23号胚性愈伤在转基因过程中因农杆菌过度增殖而污染死亡的现象，并成功实现其遗传转化。本发明具体包括如下步骤：

获得川蔗23号遗传转化所需受体胚性愈伤组织；预培养及预处理胚性愈伤组织；携带有植物表达载体及目的基因的农杆菌工程菌液的制备；工程菌液浸染胚性愈伤组织；胚性愈伤组织与农杆菌共培养；抗性愈伤、抗性芽及抗性小苗筛选培养；抗性植株PCR检测。

所述的胚性愈伤组织是以川蔗23号的幼嫩叶鞘为外植体，经(常规)灭菌后切成幼叶卷(厚度为0.3cm左右)，接种于胚性愈伤诱导培养基上，25℃黑暗培养，诱导胚性愈伤组织。胚性愈伤诱导培养基以MS为基本培养基并添加1～2mg·L^-1的2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）与0～50mg·L^-1的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。受体材料以诱导40～50d呈淡黄色、结构疏松、颗粒状、胚性一致的愈伤组织为转化最佳受体。

所述的预培养是将胚性愈伤转入胚性愈伤诱导培养基中，于25℃黑暗培养3～4d。预处理是将胚性愈伤于浸染前在超净工作台风干处理30～45min，至其微微干缩。