[发明专利]一种筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于同源重组原理的无标记基因敲除方法和基于β-半乳糖苷酶活性的双交换子菌落筛选方法，尤其涉及一种高效筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌（A.thiooxidans）无标记基因敲除菌株的方法。

背景技术

嗜酸性氧化硫硫杆菌（Acidithiobacillus thiooxidans，简称A.thiooxidans）是一种极端嗜酸性、革兰氏阴性、专性化能自养细菌，能利用各种还原性或部分还原性无机硫化物（RISCs）获得生长繁殖所需的能量，通过卡尔文循环固定空气中的CO₂作为主要碳源。在细菌冶金、煤的脱硫等方面发挥了重要作用，作为一种重要的浸矿微生物，与嗜酸性氧化亚铁硫杆菌（A.ferrooxidans）联合浸矿能显著提高后者对硫化矿的浸出效率。但是由于A.thiooxidans的营养类型为专性化能自养菌，具有生长缓慢、代时长和细胞得率低的特点，且对矿物中所含的某些重金属离子缺乏抗性，不仅限制了A.thiooxidans的基础研究，而且限制了A.thiooxidans的实际应用。为了深入研究A.thiooxidans的基因功能、代谢途径及其各种抗逆机制，构建高效浸矿工程菌，提高A.thiooxidans的应用效能，必须使用分子生物学方法对其进行遗传改造，因此，构建能对A.thiooxidans进行稳定遗传改造的体系是当下亟待解决的问题。

发明人的实验室在国际上率先在A.thiooxidans中建立了基于接合转移原理的遗传转移系统，将具有接合转移功能的广泛宿主范围质粒从大肠杆菌中转入A.thiooxidans中（Jin SM,YanWM and Wang ZN，Appl.Environ.Microbiol.,1992,Vol.58.No.1,429-430），并成功实现了外源基因在A.thiooxidans中的异源表达，提高了A.thiooxidans外源有机质的利用能力（Tian,KL,.Lin JQ,Liu XM,Liu Y,Zhang CK and Yan WM,Biotechnol.Lett.,2003,Vol.25,No.10,749-754）。但是以质粒形式携带外源基因在A.thiooxidans中进行表达的遗传改造方法存在以下不足：稳定性差，必需使用抗生素保证质粒稳定存在于A.thiooxidans中；质粒上携带的外源基因有限，不能对同一种菌多个遗传性状进行改造。无标记基因敲除——这一染色体水平稳定的遗传操作技术不仅能解决上述问题，还将为A.thiooxidans的遗传改造提供一种新方法。

基因敲除技术是深入研究基因的功能、生长代谢途径关键酶和稳定改良生物遗传性状的重要遗传操作手段。发明人在嗜酸性硫杆菌属的嗜酸性氧化亚铁硫杆菌（Wang H,Liu X,Liu S,Yu Y,Lin J,Lin J,Pang X,Zhao J，Appl.Environ.Microbiol.，2012,Vol.78,No.6,1826-1835，刘相梅，王慧妍，于洋洋，刘双双，林建群，林建强，庞昕，极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的无标记基因敲除方法，国家发明专利，专利号ZL201110188474.X，授权公告日2013,01,09）以及发明人的实验室在嗜酸性硫杆菌属的嗜酸性喜温硫杆菌（林建群，吴燕，张成家，林建强，嗜酸性喜温硫杆菌的基因无痕敲除和整合方法，国家发明专利，申请号201210089108.3，申请公布日2012,07,25）中已经建立了基于同源重组原理的无标记基因敲除方法,使用该方法敲除靶基因后，染色体上不存在抗生素抗性基因的残留，可适合基因组中多基因敲除和置换的研究。但是，在嗜酸性硫杆菌属的嗜酸性氧化硫硫杆菌中还没有无标记基因敲除技术的报道，阻碍了该菌的遗传改造和应用研究，而且在嗜酸性氧化亚铁硫杆菌和嗜酸性喜温硫杆菌已有的无标记基因敲除技术中，双交换子失去了抗生素抗性基因，由于缺少选择压力以及同源重组频率低，存在双交换子筛选非常困难的问题，成为整个敲除流程中的瓶颈，需要通过分离纯化获得大量的单菌落，并对每个单菌落逐一进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测筛选和验证，不仅耗时、耗力、效率低，还增加了实验的成本。

发明内容

针对以上嗜酸性氧化硫硫杆菌中尚未建立无标记基因敲除技术以及嗜酸性氧化亚铁硫杆菌和嗜酸性喜温硫杆菌已有的无标记基因敲除技术中存在筛选效率低和工作量大的问题，本发明提供了一种高效筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌（A.thiooxidans）无标记基因敲除菌株的方法。