[发明专利]溴苯腈还原脱卤酶基因簇bhbA2B2 及其应用

说明书

技术领域

本发明属于应用环境微生物领域，涉及溴苯腈还原脱卤酶基因簇bhbA2B2及其应用。 

背景技术

农药的使用虽然提高了农业的生产效率及作物产量，但同时带来严重的环境问题，造成生态失衡农产品品质下降，并直接影响人民的身体健康。溴苯腈(Bromoxynil)，化学名称为3,5-二溴-4-羟基苯甲腈，属有机氰化物，是一种具有传导活性的选择性苗后茎叶处理触杀型除草剂。根据最新《农药化学品》杂志通过对20世纪全球农药市场情况的调查总结表明，在20世纪农药革命的高潮中，应用最广和对全球农业影响最大的二十二种农药中，其中除草剂8种，而溴苯腈类就是这8种除草剂之一。溴苯腈于1963年被研究开发，1994年后逐步在我国推广应用。目前我国已成为全球溴苯腈主要的生产国，年产大约8000-10000吨。由于溴苯腈使用量大、范围广泛，在作物、地下水和土壤中残留，造成了严重的环境污染问题。随着人类环保意识的增强，溴苯腈及其代谢产物污染的修复引起了人们的广泛关注。微生物修复农药污染的方法一种简单、高效、廉价和无二次污染的方法，比化学方法、物理方法修复农药污染具有很多优势。微生物在农药残留的生物学解决途径中有着独特的作用。微生物降解修复农药的本质是微生物产生的酶对农药的降解作用，从微生物中提取的降解酶系来消除农药残留在国外已有成功的先例，降解酶的来源可以通过从降解菌中提取，也可以采用基因工程手段构建高效表达菌株来获得。溴苯腈脱卤酶基因的获得在溴苯腈及其代谢产物污染的修复领域有巨大的应用潜力。同时可通过基因改造扩大脱卤酶的作用底物范围，广泛应用于环境中卤代芳香烃类污染物的脱卤降解，保护环境。 

发明内容

本发明的目的是提供除草剂溴苯腈及其腈水解产物的还原脱卤酶基因簇bhbA2B2。 

本发明的另一目的是提供除草剂溴苯腈及其腈水解产物的还原脱卤酶基因簇编码的蛋白质BhbA2B2。 

本发明的又一目的是提供该基因簇bhbA2B2的应用。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现： 

溴苯腈还原脱卤酶基因簇bhbA2B2，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5，主要由细胞膜结合受体蛋白基因bhbB2和溴苯腈还原脱卤酶基因bhbA2构成。 

一种溴苯腈还原脱卤酶基因bhbA2，核苷酸序列为SEQ ID NO.1。该基因全长（从起始密码子到终止密码子）为3216bp，G+C含量为57.93%，编码1071个氨基酸；其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。 

一种细胞膜结合受体蛋白基因bhbB2，核苷酸序列为SEQ ID NO.3。该基因全长（从起始密码子到终止密码子）为993bp，G+C含量为60.53%，编码330个氨基酸，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.4。 

含有本发明所述溴苯腈还原脱卤酶基因簇的重组质粒pBBR1MCS2-bhbA2B2。 

溴苯腈还原脱卤酶基因簇片段与BamHI和XbaI酶切好的pBBR1MCS2进行酶连获得溴苯腈还原脱卤酶基因簇的重组质粒pBBR1MCS2-bhbA2B2。 

含有本发明所述的重组质粒的重组微生物Comamonas sp.2B-bhbA2B2。 

将酶连好的重组质粒pBBR1MCS2-bhbA2B2，通过三亲接合转化到受体菌株Comamonas sp.2B中，获得重组微生物Comamonas sp.2B-bhbA2B2。 

上述溴苯腈还原脱卤酶基因簇、含有该基因簇的重组质粒及重组微生物可以在农作物、土壤、水体的溴苯腈及其腈水解产物残留去除方面得到应用。 

其所涉及的溴苯腈还原脱卤酶蛋白和细胞膜结合受体蛋白可以在农作物、土壤、水体的溴苯腈及其腈水解产物残留去除方面应用。 

有益效果 

1.从丛毛单胞菌菌株Comamonas sp.7D-2（从溴苯腈污染土壤中分离筛选获得的溴苯腈降解菌株，其16S rRNA基因序列的GenBank登录号为JX455142，专利菌种保藏编号为CGMCC No.6931）中提取出溴苯腈降解野生型大质粒，并通过454高通量测序获得溴苯腈还原脱卤酶基因簇bhbA2B2。