[发明专利]一种用于促通读药物筛选的有限细胞株的建立方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物工程动物细胞株领域，具体涉及一种用于促通读药物筛选的有限细胞株的建立方法，更具体的说是一种双荧光哺乳动物表达载体及其PTC突变体有限细胞株的建立方法和依照该方法建立的双荧光哺乳动物表达载体及其PTC突变体有限细胞株。

背景技术：

根据人类基因组突变数据库（Human Genome Mutation Database，HGMD，http://www.hgmd.org)2012年权威统计，由于移码突变、选择性剪切或者直接的无义突变，在人类基因组上形成了提前终止密码子（Premature termination codons，PTC），PTC的存在使机体产生截断型的蛋白质或者具有负显性效应的蛋白质，有三分之一的人类遗传疾病是由此导致的；11.2%的人类遗传疾病是由于无义突变直接引发或者是伴随出现的。

临床治疗遗传疾病的主要方向之一就是通过对PTC的促通读，从而抑制产生截断型蛋白质，促进产生全长的有活性的蛋白质来缓解和治疗遗传疾病。

目前基因内PTC的通读研究是分子细胞生物学的热点之一，对由此导致的遗传疾病的治疗具有潜在应用价值。主要针对的遗传疾病有囊性纤维化病变（cystic fibrosis，CF）、杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）、血友病A和B（hemophilia A，HA andB，HB）、家族性良性天疱疮（Hailey-Hailey disease，HHD）和粘多糖贮积症（mucopolysaccharidosis，MPS）。

药物促PTC通读表达还用于基因无义突变导致的癌症、肿瘤和部分遗传疾病的机理研究，并且取得了长足的进展，取得了一系列有意义的分子学数据和试验结果。

研究表明，氨基糖苷类（例如gentamicine）化合物能够结合到核糖体的识别中心（decodingcenter），降低密码子和反密码子配对的准确性，引起mRNA中密码子的错读，在培养的动物细胞和人体细胞中都得到了实验的证实；化合物PTC124，与氨基糖苷类药物结构上不同，而促通读效率很高，已经用于三期临床，商品名Ataluren。目前国内外缺乏高通量的细胞水平药物筛选体系，因此急需建立相应的细胞株供体外筛选由于无义突变导致的疾病的潜在药物，更可用于筛选由于无义突变引发的遗传性疾病的临床治疗药物。

发明内容：

本发明旨在解决上述问题，而提供一种用于促通读药物筛选的有限细胞株的建立方法，以及依照该方法建立的双荧光哺乳动物表达载体及其PTC突变体有限细胞株。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种双荧光基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

一种哺乳动物表达载体，含有上述双荧光基因，载体命名为pDsRed-EGFPmtag-。

一种用于促通读药物筛选的有限细胞株的建立方法，包括如下步骤：

1）利用基因重组技术将DsRed和EGFP基因克隆到pEGFP-N1哺乳动物表达载体上，构建成pDsRed-EGFP，重组质粒经酶切鉴定；

2）利用PCR快速定点突变方法，将DsRed基因的终止密码子tag突变至tac，并且调整DsRed和EGFP基因至一个阅读框，构建成双荧光表达载体pDsRed-EGFPmtag-；

3）利用PCR定点突变的方法，将绿色荧光蛋白EGFP的445氨基酸位置突变为含有一个提前终止密码子，得到双荧光哺乳动物表达载体的突变体pDsRed-EGFPmtag-Y445X；

4）培养非洲绿猴肾细胞Cos-7，培养基为DMEM，添加10%胎牛血清，不添加任何抗生素培养，胰酶消化细胞，按2×10⁵cell/mL密度种于6孔板；

5）利用脂质体Lipofectamine^TM2000将质粒pDsRed-EGFPmtag-和pDsRed-EGFPmtag-Y445X分别转染Cos-7细胞，转染8小时后，更换新鲜培养液得到有限细胞株。

用促通读药物PTC124处理有限细胞株，48小时后，用激光共聚焦显微镜观察细胞，上样流式细胞仪，实时定量PCR检测药物促通读的效率。