[发明专利]一种绵羊卵母细胞体外成熟培养方法

说明书

技术领域

本发明属生物细胞技术领域，具体涉及绵羊卵母细胞体外成熟的培养方法。

背景技术

卵母细胞体外成熟是哺乳动物体外受精、单精子显微注射、细胞核移植、转基因等胚胎生物技术的首要环节，是胚胎工程的一项关键技术。自从德国科学家Schenk于1878年首次证明卵母细胞在体外环境下可以成熟以来，许多学者对哺乳动物卵母细胞体外成熟培养进行了大量的研究。我国从20世纪80年代末开始对家畜卵母细胞体外成熟培养进行研究，取得较大进展，旭日干等将绵羊卵母细胞进行体外成熟培养并受精，经胚胎移植后获得后代。目前，绵羊卵母细胞体外成熟通常采用的培养时长为24小时，其技术改进主要集中在向成熟培养液中添加血清、生长因子、细胞因子或抗氧化物质等方面，如今卵母细胞经体外成熟能够发育至囊胚的比率为20%～30%，其胚胎发育能力尚有较大提升空间。

卵母细胞体外成熟包括细胞核成熟和细胞质成熟。卵母细胞体外成熟质量的高低是决定其随后发育能力的关键因素。体外成熟卵母细胞的胚胎发育能力低与卵母细胞的细胞核成熟与细胞质成熟不同步有关。在卵母细胞体外成熟过程中，由于卵母细胞脱离卵泡抑制环境，可自发恢复减数分裂，在较短的时间内即可达到细胞核成熟，但此时卵母细胞的细胞质却没能达到同步成熟。然而，这一问题并不能通过在卵母细胞达到核成熟后继续延长卵母细胞体外成熟时间的方法得到解决。因为卵母细胞一旦达到细胞核成熟，再延长卵母细胞成熟时间会导致其老化，不但不能提高卵母细胞的随后发育能力，反而会引起其随后发育力能力的降低。可见，发明一种新的卵母细胞体外成熟方法，适当延迟卵母细胞的核成熟进程，使细胞核和细胞质成熟趋于同步，必将有利于提高体外成熟卵母细胞的发育能力。

调控卵母细胞核成熟进程的关键因素是卵母细胞内环腺苷酸（cAMP）水平的变化。当卵母细胞内cAMP水平降低到某阈值之下，卵母细胞减数分裂恢复，启动细胞核成熟进程；而当卵母细胞内cAMP在一定时期内维持较高水平时，则可抑制卵母细胞减数分裂的恢复，从而延长细胞核成熟进程。可见，有效升高卵母细胞内cAMP水平是延长卵母细胞核成熟进程的关键。在卵母细胞体外成熟初期，紧密包裹卵母细胞的大量卵丘细胞可合成cAMP，并通过卵丘细胞绒毛嵌入卵母细胞内所形成的缝隙连接向卵母细胞输送cAMP，因此卵母细胞内cAMP水平的变化主要决定于卵丘细胞所合成cAMP的量。但随着成熟时间的延长，这种缝隙连接的强度会随着卵丘细胞的向外扩散而减弱，而使输入卵母细胞中的cAMP量减少，此时卵母细胞内cAMP水平的变化则主要取决于卵母细胞中cAMP的降解速率。cAMP的合成受腺苷酸环化酶(AC)的调控，而cAMP的降解则受磷酸二酯酶(PDE和PDE3)的控制。AC和PDE较广泛地分布于卵丘细胞中，PDE3则主要分布在卵母细胞内。毛喉素（FSK）能激活AC的活性使卵丘细胞合成cAMP的能力增加，3－异丁基－1－甲基黄嘌呤（IBMX）则可抑制PDE的活性使卵丘细胞中cAMP的降解速度减慢，这两种物质的共同作用的结果是提高卵丘细胞中cAMP的含量；西洛酰胺（Cilostamide）为PDE3的特异性抑制剂，使卵母细胞内中cAMP的降解速度减慢，从而使卵母细胞在较长时间内维持较高水平的cAMP。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绵羊卵母细胞体外成熟培养方法，通过利用FSK、IBMX和Cilostamide延长卵母细胞的细胞核成熟进程，使绵羊卵母细胞在体外成熟过程中的细胞核和细胞质成熟趋于同步，从而提高成熟卵母细胞的发育能力。

为实现上述目的，本发明由以下步骤组成：1、配制绵羊卵母细胞体外成熟培养基础液（IVM基础液）：IVM基础液的配方为TCM199（液体）+10% FBS(v/v)+10 μg/ml FSH+10 μg/ml LH +1 μg/ml E₂ +1 mmol/L L-谷氨酰胺+20 ng/ml EGF。

2、配制绵羊卵母细胞体外成熟培养液的Ⅰ液（IVMⅠ液）和Ⅱ液（IVMⅡ液）：IVMⅠ液的配方为IVM基础液+100 μmol/L的IBMX+ 50～100 μmol/L FSK；IVMⅡ液的配方为IVM基础液+5 μmol/L 的Cilostamide。

3、绵羊卵母细胞的体外成熟：在39℃、5% CO₂及饱和湿度条件下，分两步完成：绵羊卵母细胞先在IVMⅠ液中体外成熟培养2小时，进行第1步成熟；然后再将卵母细胞转入IVMⅡ液中体外成熟培养28小时，进行第2步成熟。