[发明专利]天山雪莲sikSAD基因启动子在转基因植物中的应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种从菊科凤毛菊属植物天山雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir)中克隆得到sikSAD基因启动子，构建植物表达载体，转化植物，能够调节目标基因在低温条件下的表达。

背景技术：

低温是对植物生长最具威胁力的逆境之一，也成为影响农作物产量和品质的重要因素。因此深入研究植物的耐低温性能和机制，是当前科学研究的重点问题。低温和冷害首先使植物的生物膜系统发生伤害。低温对膜脂的直接影响是改变膜脂各成分的相对含量及其脂肪酸组成，尤其是后者意义重大。因为脂肪酸组分的变化与膜的流动性和稳定性关系更为密切。温度诱导的不饱和程度的变化可以确保生物膜的流动性，这对生物膜蛋白的正常生理功能是必不可少的。Δ9硬脂酰-ACP脱饱和酶是质体中脂肪酸合成途径的第一个脱饱和酶，它催化硬脂酸转变为油酸，在决定植物饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸含量和比例中起着重要的作用。雪莲能够在急剧变化的低温环境中正常生长，它在长期的进化过程中，一定演化出了一套适应低温环境，维护生物膜稳定的调控机制，是低温膜生物学研究的良好材料。从雪莲的Δ9硬脂酰-ACP脱饱和酶基因入手，系统地对它低温响应机制进行研究，比较它与拟南芥SAD基因的功能差异，分析它们表达调控的不同特点，这有助于进一步深入探讨低温条件下植物生物膜的生理功能，揭示生物膜的冷伤害和低温光抑制分子机制，提高植物对环境的适应性等方面都有着重要意义。

启动子是提供RNA聚合酶识别和结合的一段DNA序列，是一种基因表达调控的重要的顺式作用元件，它位于基因的上游，生物种类不同长度也不尽相同。RNA聚合酶一旦定位结合到启动子序列上，转录则被启动。绝大多数基因在调控表达上因与其调控元件相关，而呈现出有空间性和时间性的特点。

本研究根据Genbank收录的sikSAD基因序列，设计反向引物，采用TAIL-PCR克隆出天山雪莲(Sasussured involucrata Kar.et Kir)sikSAD基因启动子序列，扩增片段长度为946bp。并用PlantCARE启动子在线分析软件分析其功能元件。将其与GUS基因融合，构建植物表达载体pCAMBIA1301-PsikSAD-GUS，通过农杆菌介导法转化NC89型烟草和野生型拟南芥。

发明内容：

根据Genbank收录的sikSAD基因序列，设计反向引物，采用TAIL-PCR克隆出天山雪莲(Sasussured involucrata Kar.et Kir)sikSAD基因启动子序列，并命名为PsikSAD。为了研究该启动子的功能，我们构建pCAMBIA1301-PsikSAD-GUS植物表达载体，农杆菌介导法转化烟草，用PCR和RT-PCR鉴定转基因植株，并对鉴定正确的转基因植株拟南芥进行GUS染色。

本发明的一个目的是为植物抗寒育种提供有价值的sikSAD基因启动子PsikSAD，其发明的目还在于构建植物表达载体：pCAMBIA1301-PsikSAD-GUS，在转基因植物中调节目的基因的表达。

本发明的目的是通过以下过程和方法实现的：

本发明所述的从天山雪莲中克隆sikSAD基因启动子，其序列为<210>1。

本发明的从天山雪莲中克隆sikSAD基因启动子的过程如下：

根据Genbank收录的sikSAD基因序列，利用Primer5.0设计反向引物Gsp1，Gsp2，Gsp3及5条随机引物AD1，AD2，AD3，AD4，AD5；T7和SP6为pGM-T载体上的通用引物(见图1)。以雪莲DNA为模板，运用TAIL-PCR方法(LIANG et al.，2010)，进行PCR扩增；PCR反应结束后，引物AD1，AD2和AD5均获得了较长的PCR产物。分别对3组产物进行回收，T7和SP6通用引物PCR鉴定后，筛选800bp-1200bp之间的单克隆，送至华大基因测序，将测序结果与sikSAD基因的序列比对，选择搭接序列最多的一个单克隆，获得了总长度946bp的序列信息。用该单克隆序列加入酶切位点，并设计sikSAD启动子特异性引物。

利用上述基因构建植物表达载体pCAMBIA1301-PsikSAD-GUS通过农杆菌介导法遗传转化获得转基因植物并对其功能进行分析。

本发明不仅得到天山雪莲sikSAD基因启动子，而且将其构建成的植物表达载体，在转基因植物中研究了该基因在调节目的基因在植物中的表达。这对于揭示雪莲的抗寒机理，丰富植物抗寒分子生物学理论，提高植物的耐寒能力，具有重要的意义。