[发明专利]用于重组蛋白表达的经工程改造的低等真核宿主菌株

说明书

技术领域

本发明涉及用于表达异源蛋白的新颖的经工程改造的低等真核宿主细胞和产生这样的菌株的方法。

背景技术

可以工程改造低等真核宿主细胞以生产异源蛋白。此外，可以对低等真核宿主细胞进行糖工程改造以生产糖蛋白，其中从它们的天然形式修饰N-或O-连接的糖基化。

已经将工程改造的毕赤酵母属(Pichia)菌株用作生产具有人-样糖基化的重组糖蛋白的替代宿主系统。但是，广泛的遗传修饰也已经在许多糖工程改造的酵母菌株中造成细胞壁结构的根本变化，从而使这些菌株中的一些易于在发酵过程中的细胞裂解和降低的细胞稳健性。某些糖工程改造的菌株具有细胞生存力的大幅下降以及显著增加的细胞内蛋白酶向发酵液中的渗漏，从而导致重组产物产率和质量二者的下降。

用于鉴别稳健的糖工程改造的生产菌株的现有策略高度依赖于使用不同平台(诸如96-深孔平板、5ml微型发酵罐和1L-规模生物反应器)筛选大量克隆，以经验性地鉴别适合用于大规模(40L和以上)发酵过程的克隆(Barnard等人，2010)。尽管事实上已经使用高通量筛选成功地鉴别出几个能够以超过1 g/L的产率生产重组单克隆抗体的毕赤酵母属宿主(Potgieter等人. 2009；Zhang等人，2011)，但是这些大规模筛选方案是非常资源密集的和费时的，且经常仅鉴别出具有细胞稳健性的逐步增加的克隆。

因此，具有提高的稳健性和生产具有人-样聚糖的高质量蛋白的能力的低等真核宿主菌株在本领域中是有价值的和重要的。在这里，本发明人提供了具有新颖基因ATT1 (获得性热耐受性)中的缺失、截短或无义突变的经工程改造的毕赤酵母属宿主菌株，其在有关的生物过程条件下表现出改善的生存力、稳定性和蛋白生产。令人惊奇地，在有关的生物过程条件下过表达ATT1或其片段的经工程改造的毕赤酵母属宿主菌株也表现出改善的生存力、稳定性和蛋白生产。这些菌株对于异源基因表达而言是特别有用的。

发明内容

本发明涉及经工程改造的低等真核宿主细胞，其已经被修饰以减少或消除ATT1基因的活性。可以通过任意方式减少ATT1基因的活性。在一个实施方案中，通过减少或消除ATT1基因的表达(例如通过使用干扰RNA或反义RNA)，减少或消除ATT1基因的活性。在另一个实施方案中，通过突变ATT1基因或它的产物，减少或消除ATT1基因的活性。在另一个实施方案中，通过降解ATT1多肽，减少或消除ATT1基因的活性。在另一个实施方案中，通过使用ATT1的抑制剂，例如小分子抑制剂或抗体抑制剂，减少或消除ATT1基因的活性。本发明包括灭活ATT1基因或它的蛋白的任意方式，包括转录方式、翻译方式或翻译后方式(例如，使用阻抑型启动子、干扰RNA、反义RNA、可诱导的蛋白降解等)。在一个实施方案中，所述低等真核细胞是糖工程改造的低等真核宿主细胞。在一个实施方案中，所述低等真核细胞是缺乏OCH1活性的低等真核宿主细胞。在一个实施方案中，所述低等真核宿主细胞是真菌宿主细胞。在一个实施方案中，所述低等真核细胞是缺乏OCH1活性的真菌宿主细胞。在一个实施方案中，所述低等真核宿主细胞是酵母宿主细胞。在一个实施方案中，所述低等真核细胞是缺乏OCH1活性的酵母宿主细胞。在一个实施方案中，所述低等真核宿主细胞是毕赤酵母属种(Pichia sp.)。在一个实施方案中，所述低等真核细胞是缺乏OCH1活性的毕赤酵母属种宿主细胞。在另一个实施方案中，所述宿主细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，且所述ATT1基因编码包含SEQ ID NO:7的氨基酸的多肽或其多形物(polymorph)。在另一个实施方案中，所述宿主细胞是多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，且所述ATT1基因编码包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的多肽或其多形物。