[发明专利]来自游动放线菌属菌种SE50/110的新的放射菌整合和接合元件作为用于相关放线菌基因转化的质粒

说明书

发明描述

原核生物游动放线菌属(Actinoplanes)菌种SE50/110产生α-葡糖苷酶抑制剂阿卡波糖，其在世界范围内用于治疗2型糖尿病。基于在世界范围内2型糖尿病的发病快速增长的事实，预期未来对阿卡波糖的需求不断增加。为了满足这些预期，需要对菌株和其衍生物进行基因操作，旨在增加阿卡波糖产量。然而，目前对于该菌株尚无用于基因操作的工具，阻碍了改进菌株的进程。

本发明涉及游动放线菌属菌种SE50/110的完整基因组序列内的固有DNA序列，其与放射菌整合和接合元件(antinomycete integrative and conjugative element，AICE)的结构相似。相关AICEs过去用于建立用于其他细菌的基因操作工具。在本文中，我们描述了游动放线菌属菌种SE50/110中发现的特定AICE的独特性质，所述特定AICE作为整体与任意其他已知的AICE明显不同，但是与从其他菌种中鉴定得到的AICEs共有具有不同序列相似度的微小部分。

发明描述

游动放线菌属菌种SE50/110是一种革兰氏阳性需氧菌，其基因组G+C含量高，大小约为9.25MB(Schwientek等人，2012)。这种在医学上重要的生物是发现抑制人α-葡糖苷酶的多种化学相关物质的天然生产者，这使得其特别适合用于药学应用(Frommer等人，1975，1977a，1977b，1979)。特别是伪四多糖(pseudotetrasaccharide)阿卡波糖，其通过已明确表征的阿卡波糖基因簇中编码的酶合成(Wehmeier和Piepersberg，2004)，在世界范围内用于治疗2型糖尿病(非胰岛素依赖型)。

2型糖尿病是一种慢性疾病，在世界范围内危害超过2亿5千万人。如果处理不当或者不治疗，其可以导致肾脏衰竭、失明、伤口愈合缓慢和动脉疾病，包括冠状动脉粥样硬化的严重情况(IDF，2009)。由于在世界范围内2型糖尿病的发病快速增长，需要预料到对于糖尿病药物例如阿卡波糖的需求不断增加。目前，伪四多糖阿卡波糖通过经产量优化的菌株的工业发酵而生产，所述菌株是基于野生型细菌游动放线菌属菌种SE50/110(ATCC 31044；CBS 647.73)。尽管过去通过常规突变进行的经典菌株优化是增加阿卡波糖生产的非常成功的途径，现在该方案似乎达到了其限值。为了进一步增加生产效率，必须应用靶向基因工程，这需要使用用于游动放线菌属菌种SE50/110的功能性转化系统。先前的实验表明游动放线菌属菌种SE50/110和Actinoplanes friuliensis(以及可能大部分其他游动放线菌菌种)不能使用标准转化方法例如电穿孔或PEG介导的转化，尽管进行过认真的尝试(Heinzelmann等人，2003)。在本文中，在游动放线菌属菌种SE50/110基因组(GenBank：CP003170)上鉴定出了放射菌整合和接合元件(AICE)，其可以如先前已经用于相关菌种(Hosted等人，2005)所示用于该目的。

AICEs是一族具有高度保守的结构组成的移动性基因元件，其具有用于切除/整合、复制、接合转移和调控的功能性模块(te Poele，Bolhuis等人，2008)。由于能够自主复制，其据说还能够介导获得编码其他功能的额外模块，例如在某些环境条件下赋予宿主选择优势的耐受性或代谢性质(Burrus和Waldor，2004)。在游动放线菌属菌种SE50/110完整基因组中鉴定出了一种新的AICE，命名为pACPL(图1)。其13.6kb的大小和结构基因组成与紧密相关菌种(例如Micomonospora rosario、Salmispora tropica或者天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor))的其他已知AICEs吻合较好。

图1.从游动放线菌属菌种SE50/110中新鉴定出的放射菌整合和接合元件(AICE)pACPL的结构组成。其他AICEs上也可以找到的常见基因以颜色示出：切除/整合(桔色)，复制(黄色)，主转移(深蓝色)，接合(蓝色)，NUDIX水解酶(深绿色)，调控(绿色)，其他经注解的功能(红色)，未知功能(灰色)。