[发明专利]用于柄锈菌亚门和黑粉菌亚门的基因操作和表达系统

权利要求书

1.一种多核苷酸构建体，其包含可操作地连接可选择标记的编码序列的启动子，所述可选择标记的编码序列可操作地连接至转录终止子，其中所述可选择标记的编码序列由SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列组成，其中所述启动子衍生自选自下述的真菌物种：黑粉菌(Ustilago)属的物种、曲霉菌(Aspergillus)属的物种、红冬孢酵母(Rhodosporidium)属的物种；掷孢酵母(Sporobolomyces)属中的物种；红酵母(Rhodotorula)属中的物种，并且其中所述多核苷酸构建体提供圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)的经转化的真菌细胞的有效和显性的选择。

2.权利要求1的构建体，其中所述启动子衍生自编码甘油醛3-磷酸脱氢酶gpd的基因或编码蛋白质翻译延伸因子tef的基因。

3.权利要求1的构建体，其中所述启动子选自由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成的启动子、由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成的启动子、由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列组成的启动子、由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成的启动子、由SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列组成的启动子、由SEQ ID NO:51所示的核苷酸序列组成的启动子、由SEQ IDNO:55所示的核苷酸序列组成的启动子、和由SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列组成的启动子。

4.一种用于转化柄锈菌(Pucciniomycotina)亚门和黑粉菌(Ustilaginomycotina)亚门的物种的真菌细胞的方法，其包括：

(a)用权利要求1的构建体转化真菌细胞，和

(b)选择经转化的真菌菌落。

5.权利要求4的方法，其中所述真菌细胞是红冬孢酵母属、孢堆黑粉菌属(Sporisorium)、黑粉菌属、红酵母属、Pseudozyma或掷孢酵母属的物种。

6.权利要求4的方法，其中所述启动子衍生自编码甘油醛3-磷酸脱氢酶gpd的基因或编码蛋白质翻译延伸因子tef的基因。

7.权利要求4的方法，其中所述启动子选自由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成的启动子、由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成的启动子、由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列组成的启动子、由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成的启动子、由SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列组成的启动子、由SEQ ID NO:51所示的核苷酸序列组成的启动子、由SEQ ID NO:55所示的核苷酸序列组成的启动子、和由SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列组成的启动子。

8.权利要求4-7中任一项的方法，其中所述转化包括使所述真菌细胞与根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)一起共培养的步骤，所述根瘤土壤杆菌含有包含所述构建体的载体，并且所述共培养在固体共培养培养基上进行或在置于固体培养基之上的共培养膜上进行。

9.权利要求8的方法，其中所述选择通过将固体选择培养基覆盖到所述固体共培养培养基之上进行或通过将所述共培养膜转移至固体选择培养基来进行。

10.权利要求8的方法，其中所述共培养培养基含有至少1.5％琼脂。

11.权利要求10的方法，其中所述共培养培养基含有2％-3％琼脂。

12.权利要求9的方法，其中所述共培养培养基和所述选择培养基含有至少1.5％琼脂。

13.权利要求11的方法，其中所述共培养培养基和所述选择培养基含有2％-3％琼脂。

14.一种用于减少靶向基因组中的假转化体的方法，其包括步骤：

(a)用权利要求1-3中任一项的构建体转化所述靶向基因组的细胞；和

(b)在选择剂的最大浓度下选择经转化的细胞。