[发明专利]荧光粒子的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及使用共聚焦显微镜、或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学体统而检测荧光粒子的方法。

本申请基于2011年8月12日在日本提交的日本特愿2011-176699号主张优先权，本文援引其内容。

背景技术

随着近年来光学测量技术的发展，使用共聚焦显微镜的光学系统和能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测定单光子或单分子荧光水平的微弱光。因此，提出了使用这样的微弱光的检测技术，进行生物分子等分子间相互作用或者分子间的结合/解离反应的检测的各种装置或方法。例如，荧光相关分光分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy：FCS。例如，参见专利文献1、2、非专利文献1～3)中，使用激光共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术，对于进出试样溶液中的微小区域内的荧光分子或被荧光标记的分子所发出的荧光强度进行测定。由该测定的荧光强度的自相关函数的值确定微小区域内的荧光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)以及滞留的分子个数的平均值。基于微小区域内的荧光分子等的平均滞留时间以及滞留的分子个数的平均值，实现取得荧光分子等的运动速度或大小、浓度这类信息，或者检测到分子的结构或大小的变化、分子的结合/解离反应或分散/聚集的各种现象。需要说明的是，前述微小区域是指显微镜的激光束被聚光的焦点区域，被称为共焦体积。另外，荧光强度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：FIDA。例如，专利文献3)、光子计数直方图(Photon Counting Histogram：PCH。例如，专利文献4)，与FCS同样地，生成检测到的出入共焦体积内的荧光分子等的荧光强度的直方图。通过对该直方图的分布拟合统计学模型式，算出荧光分子等固有的明亮度的平均值和共焦体积内滞留的分子个数的平均值。根据上述信息，推测分子结构或大小的变化、结合/解离状态、分散/聚集状态等。此外，专利文献5、6中提出了：基于使用共聚焦显微镜的光学系统测定出的试样溶液的荧光信号的时程来检测荧光性物质的方法。专利文献7中提出了一种信号运算处理技术，其用于：使用光子计数技术，测量在流式细胞仪内流过的荧光微粒或固定在基板上的荧光微粒所发出的微弱光，检测液流中或基板上存在的荧光粒子。

特别是，通过应用FCS、FIDA等、使用了共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术的微小区域的荧光测定技术的方法，测定所必需的试样的浓度比以前低得多且可以是微量(每次测定使用的量最多数十μL左右),测定时间也大幅地缩短(每次测定中可重复进行数次的秒数量级时间的测定。)。因此，特别在对于医学和生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或高价的试样进行分析的情况下或者在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等被检体多的情况下，这些技术与现有的生物化学的方法相比较，可以期待能够成为低廉或迅速地进行实验或检测的强有力的工具。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2005-098876号公报

专利文献2：日本特开2008-292371号公报

专利文献3：日本专利第4023523号公报

专利文献4：国际公开第08/080417号公报

专利文献5：日本特开2007-20565号公报

专利文献6：日本特开2008-116440号公报

专利文献7：日本特开平4-337446号公报

非专利文献

非专利文献1：金城政孝、蛋白質核酸酵素、1999年、第44卷、第9号、第1431～1438页。

非专利文献2：Meyer-Alms、Fluorescence Correlation Spectroscopy、R.Rigler编、Springer、柏林、2000年、第204～224页。

非专利文献3：加藤则子等4名、遺伝子医学、2002年、第6卷、第2号、第271～277页。

发明内容

发明要解决的问题