[发明专利]用于提纯L-半胱氨酸的方法

说明书

本发明涉及用于从含L-半胱氨酸的发酵肉汤中提纯L-半胱氨酸的方法。

L-半胱氨酸是一种氨基酸，其由于良好的水溶解性和SH基对许多试剂，例如对氧化剂的高敏感性，在较大的难度和高费用下才能提纯和分离。

US2590209描述了用于将氨基酸混合物分离成酸性、中性和碱性的氨基酸的一般方法，其中首先将酸性蛋白质水解物通过阳离子交换剂，然后通过氢氧化铵洗脱酸性和中性的氨基酸，同时保留碱性氨基酸。随后使用碳酸盐溶液将这些碱性氨基酸从阳离子交换剂洗出。进而通过下游的阴离子交换剂分离酸性和中性的氨基酸，在阴离子交换剂上只结合酸性氨基酸。所述方法不适于提纯半胱氨酸，因为将碱用作洗脱剂，而半胱氨酸在高pH值下是特别对氧化敏感的。

EP1958933A1（对应US2008-0190854）描述了提纯中的问题以及分离L-半胱氨酸的现有技术。该申请描述了一种方法，其中使包含能够在pH值<5下氧化半胱氨酸的氧化剂的含L-半胱氨酸的发酵肉汤在pH为5-9下与离子交换剂接触，其中发酵肉汤中出现pH<5，优选pH<2。在此，L-半胱氨酸与离子交换剂结合，并且结合的L-半胱氨酸通过洗脱剂从离子交换剂去除。随后可通过分级结晶从洗出液中得到L-半胱氨酸单盐酸盐一水合物。通过加入浓HCl或通过引入HCl气体首先结晶出无机碱金属离子和碱土金属离子的氯化物以及氯化铵。在过滤后，将含L-半胱氨酸的母液冷却至-10℃，L-半胱氨酸盐酸盐一水合物结晶。但是，收率和纯度取决于所使用的含L-半胱氨酸溶液的纯度；高达>98重量%的纯度要求进一步的分级结晶和/或重结晶。

例如从EP0885962B1（对应US5972663A）得知用于L-半胱氨酸的发酵制备的方法。这些方法使得可以经济地得到含大量L-半胱氨酸的发酵肉汤。

这种含L-半胱氨酸的发酵肉汤是复杂的混合物。它不仅包含L-半胱氨酸，而且通常还包含在发酵条件下，特别是通过存在的氧气的氧化而易于由L-半胱氨酸形成的L-胱氨酸。如EP0885962B1所述，在醛或酮的存在下，还可存在相应的L-半胱氨酸的半硫缩酮(hemithioketal)和/或噻唑烷的衍生物。发酵肉汤还可包含少量的其它氨基酸或它们的衍生物。它们通常还包含糖类、有机和无机阳离子和阴离子的盐例如碱金属盐和碱土金属盐以及痕量的重金属盐（例如Fe、Cu、Mn、Zn等）、着色剂和其它杂质和添加剂，例如发酵中使用的微生物的不希望的代谢物。此外，发酵肉汤还可包含发酵中使用的原料和成分，例如常规碳源，例如葡萄糖、乳糖、淀粉等；氮源，例如氨/铵或蛋白质或蛋白质水解物等；以及硫源，例如硫化物、亚硫酸盐、硫酸盐、硫代硫酸盐或连二亚硫酸盐等。由于L-半胱氨酸是含硫的氨基酸，所以硫源例如硫化物、亚硫酸盐、硫酸盐、硫代硫酸盐或连二亚硫酸盐等通常在发酵过程中供入以提供用于形成L-半胱氨酸所需的足够量的硫。此外，由于发酵过程中引入氧气，溶解氧也存在于发酵肉汤中。如EP0885962B1所示，这些发酵肉汤的pH通常为7。除了发酵肉汤的组成的复杂性之外，还会出现各成分比例上的自然波动，因为肉汤是生物过程的产物。

本发明的目的是提供一种用于由含L-半胱氨酸的发酵肉汤制备提纯的含L-半胱氨酸溶液的简单、不昂贵且工业可实施的方法。

该目的通过一种方法实现，在所述方法中将含L-半胱氨酸的发酵肉汤在6-9的pH下与碱性阴离子交换剂接触，其中L-半胱氨酸与阴离子交换剂结合，用第一洗涤溶液冲洗所述阴离子交换剂，用酸将结合的L-半胱氨酸从阴离子交换剂中去除，并将其转移到洗出液中，将所述洗出液在≤4的pH下与酸性阳离子剂接触，其中L-半胱氨酸与阳离子交换剂结合，用第二洗涤溶液冲洗阳离子交换剂，并用强酸将结合的L-半胱氨酸从阳离子交换剂去除。

本发明的方法总是得到均匀的溶液，而无论发酵肉汤组成的波动，这是因为L-半胱氨酸可靠并且几乎完全地从所有伴随的物质中分离出。如需要，然后可从溶液中得到固体形式的L-半胱氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐或L-半胱氨酸盐酸盐一水合物。为此，优选浓缩所得溶液，直至结晶出理想的产物，优选是L-半胱氨酸盐酸盐一水合物。以此方式得到的L-半胱氨酸盐酸盐一水合物具有>98重量%的纯度。不需要EP1958933A1中所述的分级结晶。

优选在已分离出细胞和固体物之后，使用本发明的方法首先通过碱性离子交换剂，然后通过酸性离子交换剂提纯含L-半胱氨酸的发酵肉汤。