[实用新型]KRAS基因突变检测试剂盒

说明书

技术领域

本实用新型提供了一种KRAS基因突变检测试剂盒，属于分子生物学技术领域。

背景技术

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI) 如阿瓦斯丁（AVASTIN），特罗凯（Erlotinib），吉非替尼（irressa），西妥昔单（Erbitux)等能通过抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶阻断肿瘤细胞的信号传导，从而达到抑制肿瘤细胞的增生、侵袭、转移、血管生成并促进肿瘤细胞的调亡。

KRAS基因是编码一个GTP结合蛋白的癌基因，其表达产物是细胞表面受体如EGFR等信号传导通路上的重要蛋白。正常情况下，KRAS蛋白不存在活性，但在细胞受到外界刺激后激活EGFR等信号通路时，KRAS被活性EGFR等酪氨酸激酶磷酸化后而活化，而活化后的KRAS可以激活该信号通路中的下游信号蛋白。KRAS基因在很多癌中都发生了突变，约30-50％的直肠癌，90％以上的胰腺癌，10-20%的肺癌等都含有KRAS突变，而几乎所有的突变都发生在编码子12和13（位于第2外显子）位置上，这些突变破坏了KRAS蛋白内在的GTPase活性，从而使得KRAS蛋白处于持续活性状态。众多的研究表明，对于KRAS突变的肿瘤患者，靶向药物的疗效不佳，这主要是由于KRAS是EGFR信号通路的下游蛋白，突变KRAS的持续激活与EGFR活性是否被抑制有关。因此通过对KRAS基因的突变检测可以对EGFR-TKI药物的治疗效果做出一定的评估。

发明内容

本实用新型的目的是提供一种检测KRAS基因2号外显子上是否存在突变的试剂盒。用于评估治疗癌症个体的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂类药物的有效性。

为实现以上目的，本实用新型提供了一种KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括包装盒体、样本保存管、含有正向引物的一个试管、含有反向引物的一个试管、含有PCR扩增试剂的一个试管、含有PCR产物纯化试剂的一个试管、含DNA测序试剂的一个试管。本实用新型将样本保存、KRAS基因突变位点检测整合在一个试剂盒内，使用更方便快捷，且成本更低。本实用新型基于直接测序技术，可以对PCR产物直接进行DNA序列分析，明确突变位点，是现有基因突变检测方法中最直接最准确的方法，且可以实现机械化自动化，使测序工作更加简便快捷，结果判读更直观。

附图说明

图1为本实用新型的结构示意图；

图2为KRAS基因第2号外显子实验无突变结果示意图；

图3为KRAS基因Gly12Ser GGT>AGT突变结果示意图。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

实施例

如图1所示，为本实用新型提供的一种KRAS基因突变检测试剂盒的结构示意图，包括带盒盖的包装盒体1，包装盒体1内一侧设有样本保存管2、含有正向引物的试管3、含有反向引物的试管4、另一侧设有含有PCR扩增试剂的试管5、含有PCR产物纯化试剂的试管6和含DNA测序试剂的试管7。试管排列位置固定如图1所示。测试步骤如下：

步骤1：采集被测者血清或肿瘤组织样本，样本保存于样本保存管2中；

步骤2：采用硅胶吸附法抽提样本的基因组DNA。步骤3：PCR扩增

PCR扩增试剂（总体积为1ml）的成分包含：20mM Tris-HCL（PH8.0）、100mM KCL、500uM dNTPs、3mM MgCl₂溶液、0.1U Taq DNA聚合酶/ul。 

KRAS基因第2外显子正向和反向引物：

正相引物：cgatggaggagtttgtaaatga

反向引物：tgaaacccaaggtacatttcag

检测在ABI9700型PCR扩增仪上进行，每个样本分为1个反应孔，每个反应孔放入KRAS正反向引物各0.5ul（引物浓度为10umol/L），加入检测样品2ul，PCR反应液7.5ul，去离子水4.5ul，反应孔总体积15ul。

反应条件为95℃预热10分钟；再进行35个循环的95℃、45秒，60℃、45秒，72℃、60秒；72℃、7分钟后，降温至4℃。

步骤4：PCR产物纯化

每一个反应孔反应体系总体积为7ul，由PCR产物纯化试剂4ul和PCR产物 3ul组成。反应条件为：37℃ 、60分钟；80℃、15分钟。

步骤5：DNA测序反应