[实用新型]猪Nesfatin-1酶联免疫吸附测定试剂盒

说明书

技术领域

本实用新型涉及生物技术领域，尤其涉及一种猪Nesfatin-1(NES1)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。

背景技术

肾素-血管紧张素系统(RAS)在调节血压、电解质及体液平衡等生理功能中发挥重要作用。血管紧张素原(AGT)主要由肝脏合成并释放入血，在肾素的作用下生成10肽化合物，即血管紧张素I(AngI)，AngI在血管紧张素转换酶(ACE)作用下生成8肽AngII，后者再通过ACE作用产生7肽的AngIII。其中AngII是RAS的主要效应分子，通过作用于血管紧张素II受体1(AT1)和AT2受体，在调节血压、管球反馈、肾小管对水钠的重吸收、肾脏发育及心血管疾病的发生发展中占有重要地位。病理状态下，AngII在高血压、动脉粥样硬化以及继发性的心室肥厚等进程中发挥重要作用；同时，在糖尿病患者中，AngII可以直接或间接地抑制胰岛素信号途径，加重胰岛素抵抗。同时，该物质也可作为预测糖尿病患者发生心血管事件的危险因素。

噬菌体展示技术是以噬菌体为载体，将完整的抗体可变区片段定向插入噬菌体外壳蛋白基因区，使其产物表达并展示于噬菌体表面，通过吸附-洗脱-扩增的重复过程，筛选获得表达与已知抗原特异性结合的scFv片段的噬菌体，并通过基因改造使其成为完整抗体，改造后的抗体即可作为制备ELISA试剂盒的原料。由于目前商业化的噬菌体抗体库库容可达10¹⁰-10¹¹，使得筛选成功率大大增加，可应用在制备许多难以通过免疫动物获得的抗体中。

目前评价AngII的直接方法有高效液相色谱法(HPLC)、放射免疫法(RIA)以及酶联免疫吸附法(ELISA)。其中高效液相色谱法检测范围一般在2.5-500pg/ml，样本回收率在90％以上。但是该方法存在的缺陷也是非常明显的，存在检测仪器费用高、操作繁琐、样本需要前处理等缺点。放射免疫法检测灵敏度较高，但是由于应用到放射性物质，对于实验室的要求较高，且实验废液难处理。相比之下，ELISA法操作简便，不需大型仪器，同时由于亲和素-生物素放大的系统的应用，极大的提高了其灵敏度。制备ELISA和RIA试剂盒的重要原料就是针对AngII的特异性抗体。传统的抗体制备方法是通过免疫动物，获取能产生抗体的B淋巴细胞，在与骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞后，通过筛选得到能产生高亲和力抗体的单克隆B细胞，再免疫动物生成富含抗体的腹水。该方法技术成熟，但操作较繁琐，且对抗原的免疫原性要求高。由于AngII仅含8个氨基酸，其序列为Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe，分子量为1046.2，免疫原性较弱，不易通过免疫动物获得抗体。

抗体是决定ELISA试剂盒质量的关键因素，其亲和力、特异性直接关系到试剂盒的灵敏度、准确性以及精确性。因此，有必要选用一种简单有效的方法来获得高质量的抗体。该技术要解决的关键问题是从噬菌体库中筛选针对AngII特异性的scFv段。由于AGT的降解产物有3个，依次为AngI，AngII和AngIII，每种之间只有1-2个氨基酸的差别，因此筛选的抗体要避免与AngII之外的2种片段的交叉反应。为此，在对噬菌体进行常规的正向选择并富集之后，再进行负向选择去除能与AngI和AngIII结合的抗体，此举可保证最后所得抗体与这两个类似物无交叉反应或反应极弱，对保证试剂盒检测准确性至关重要。

其次，噬菌体库表达的仅为抗体的scFv片段，不具备传统抗体的双价结合结构，抗原结合力较弱。为此，通过将人AngII scFv和人IgG3上游铰链区/人p53四聚功能域的基因融合，利用人p53四聚功能域表达产物将AngII scFv抗体装配成四聚体，可同时结合四个抗原表位，且在空间位点上不会相互干扰，由此获得的抗体可用于制备抗人AngII的ELISA试剂盒。

实用新型内容

本实用新型的目的是提供一种猪Nesfatin-1(NES1)酶联免疫吸附测定试剂盒，包括盒盖、内部的酶标板和盒体，其中酶标板包括固相载体和包被层，固相载体为设置有多个微孔的微孔板，包被层附着在所述固相载体的微孔表面，包被层是由AngII和牛血清白蛋白依次涂布在固相载体的微孔表面上形成的复合层。

优选的，上述固相载体为9孔聚苯乙烯试剂板。

优选的，上述固相载体为8孔聚苯乙烯试剂板。

优选的，上述固相载体为0孔聚苯乙烯试剂板。