[发明专利]一种基因敲除疟原虫的建立方法

权利要求书

1.一种基因敲除疟原虫的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)构建线性化的基因敲除质粒；

(b)疟原虫成熟裂殖体的培养；

(c)基因敲除质粒(线性化)转染；

(d)基因敲除疟原虫的鉴定。

2.根据权利要求1所述的一种基因敲除疟原虫的建立方法，其特征在于，

所述步骤(a)采用基于PCR方法的三步法扩增获得线性化的基因敲除质粒：

第一步：根据目的基因的序列，设计两对引物，分别为Pi/Pii或者Piii/Piv，分别从疟原虫的DNA中同源扩增出目的基因的5’和3’端大约500bp左右片段；其中引物Pi和Piv在设计时在5’端分别加入EcoR V和Not I酶切位点，引物Pii和Piii在设计时在5’端引入与筛选标记序列互补的23bp核苷酸；

第二步：将第一步的产物和含有选择标记hdhfr或者二氢叶酸还原酶的线性化质粒混匀后，加入引物Pi和hDHFR反向引物进行PCR扩增，获得线性化的同源重组质粒前半段，加入hDHFR正向引物和Piv进行PCR扩增，获得线性化的同源重组质粒的后半段，其中hDHFR的正向和反向引物之间设计20个同源序列；

第三步：以第二步扩增得到的两种产物为模板，加入引物Pi和Piv进行PCR扩增，得到完整的线性化的基因敲除质粒。

3.根据权利要求2所述的一种基因敲除疟原虫的建立方法，其特征在于，PCR体系：主要成分包括线性化的包含hDHFR的质粒DNA，50ng PCR I产物和高保真DNA聚合酶混合物；PCR扩增条件：95℃2min，35个循环，68℃延伸，延伸时间依据需要拼接的两片段长度之和计算，1kb/min；模板浓度为50ng，引物浓度应按10pmol进行稀释一般稀释1/4获得较特异的扩增产物。

4.根据权利要求1所述的一种基因敲除疟原虫的建立方法，其特征在于，所述步骤(b)包括如下步骤：

第一步、常规腹腔注射感染鼠疟原虫17XL、17XNL或265BY，17XL和265BY能在感染后5天原虫血症达到20％左右；

第二步、摘眼球取感染疟原虫血，大约5-10×10⁷感染红细胞加入到10ml含20％FCS的RPMI1640完全培养基中，所述完全培养基中含25mM Hepes，40IUheparin，50IU ml-1，300g(1400rpm)×8min离心后，沉淀用150ml RPMI1640完全培养基重悬，置37℃孵箱中培养，孵箱中的混合气体：10％的O2，5％的CO2，85％的N2；

第三步、在培养12h后，取35ml加置10ml用60％Nycodenz/PBS配制的梯离液的表面，300g(1400rpm)×25mi n离心，收集位于界面的裂殖体，加培养基重悬后，200g(1000rpm)×8min离心洗涤，大约100μl沉淀用300μl含0.2mM CaCl2的PBS重悬，并计算裂殖体的数量。

5.根据权利要求1所述的一种基因敲除疟原虫的建立方法，其特征在于，所述步骤(c)包括如下步骤：5ml感染疟原虫的红细胞进行12小时的培养使疟原虫生长同步，用裂殖体进行电转，电转用T细胞缓冲液中程序U33，将得到的产物从尾部静脉注射感染小鼠，疟原虫复制一个周期后，饮水中加入药物处理5-6天。

6.根据权利要求6所述的一种基因敲除疟原虫的建立方法，其特征在于，所述一个周期的时间为24-30小时。

7.根据权利要求6所述的一种基因敲除疟原虫的建立方法，其特征在于，所述药物为乙胺嘧啶药物，所述乙胺嘧啶药物的配制方法为：首先用DMSO溶解至7mg/ml，然后用1M HCl调节到pH 3.5-5的水稀释到100倍。

8.根据权利要求1所述的一种基因敲除疟原虫的建立方法，其特征在于，所述步骤(d)包括如下步骤：在目的基因中间设计一对引物，正向引物b和反向引物c；5’UTR设计正向引物a；3’UTR设计反向引物d，若是敲除成功，野生型应用引物对a/c和b/d应能扩增出特异片段，而基因敲除型则不能。