[发明专利]一种快速灌制聚丙烯酰胺凝胶的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明所属领域为生物大分子检测领域，特别是涉及聚丙烯酰胺凝胶大分子检测领域。

背景技术：

在研究和诊断领域，聚丙烯酰胺凝胶是一种广泛运用的用于分离生物大分子（如脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）、多肽、蛋白质以及它们的复合物等）的分离介质。运用此项技术的基本装置为一个两端开口的细管或一个三明治型的两块平板。细管和平板用具有一定的支持强度的材质制作，如玻璃和塑料等。首先将尚未凝固的聚丙烯酰胺溶液加入到上述形状的模具中，待聚丙烯酰胺凝固成胶后，可将生物样品加到凝胶的一端，凝胶的两端分别加上正负极电极，使生物样品分子在凝胶介质中移动。由于生物样品分子的移动速度不同，因而在一段时间后，不同移动速度的生物分子就能被有效分开。一般生物样品分子或经处理以后的生物样品分子带有负电荷，电泳过程中，它们从负极向正极移动。

在一定电场下，生物分子在介质上的移动速率（泳动速率）取决于生物分子本身的电荷/质量比、生物分子的形状和大小以及介质的孔径。针对确定的样品，前两者是生物分子本身的特征，一般不会改变。操作者可以改变电泳介质的孔径来影响生物分子的泳动速率。聚丙烯酰胺凝胶的孔径首先取决于凝胶体系中丙烯酰胺单体及交联剂单体的总质量-体积浓度，即所谓的丙烯酰胺单体溶液的总质量-体积浓度，用%T表示，即%T=（丙烯酰胺单体质量+交联剂单体质量）（克）÷溶液总体积（毫升）×100%。越高的%T浓度，使形成的凝胶孔径越小，适合用于分离小分子量的生物分子。越低的%T浓度，使形成的凝胶孔径越大，适合用于分离大分子量的生物分子。常用的分离生物分子的聚丙烯酰胺凝胶浓度为4%-30%不等。影响聚丙烯酰胺凝胶的另一个因素是交联剂单体质量占所有单体的质量百分比，用%C表示，即%C=交联剂单体质量÷（丙烯酰胺单体质量+交联剂单体质量）×100%。在总的单体浓度（%T）确定的情况下，使用越少的交联剂（%C越小）获得的凝胶孔径越大，反之亦然。常用的用于核酸分子分离的凝胶的%C为5%；用于蛋白分子分离的凝胶的%C为3.3%或2.6%。此外还有其他一些原因可能会带来孔径大小的变化，如不完全的凝结和凝胶的水解等。

凝胶介质中还含有用于调节pH值、离子强度等的缓冲液体系。一般用于核酸电泳，凝胶的缓冲液常为TAE(40mMTris-乙酸，10mM EDTA)和TBE(90mM的Tris碱，90mM的硼酸和2mM的EDTA)。在非变性核酸电泳时，电泳过程保持在较低的温度，以维持核酸的结构，特别是用于分离核酸和蛋白质复合物的时候。如要使得分离的核酸分子变性（双链DNA解链；单链DNA和RNA二级结构解体），常在缓冲体系中加入足量的变性剂，如尿素和甲酰胺等，并维持较高的电泳温度。其它用于核酸电泳的缓冲液体系还有Tris/磷酸和Tris/双甘氨肽等。电泳缓冲液也使用同样成分的缓冲液，然而在核酸的变性电泳时，电泳缓冲液中常无需添加变性剂。

蛋白分子表面由于没有大量的负电荷，大多数蛋白电泳都在变性条件下进行，在此条件下，蛋白在上样缓冲液中预先处理，使蛋白表面结合上大量带负电荷的SDS（十二烷基硫酸钠）分子基团，能够在电场力的驱动下有效泳动，即所谓的SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE凝胶灌制的缓冲体系常用的是Laemmli体系（Laemmli,U.K.(1970）Nature，227,680-686.)。Laemmli体系包括分离胶和浓缩胶（也称为积层胶）两部分：分离胶的缓冲液为0.375M的Tris（用HCl滴定到pH8.8），浓缩胶的缓冲液为0.125M的Tris（用HCl滴定到pH6.8）。正负极电泳缓冲液为0.024M的Tris，0.192M的甘氨酸和0.1%的SDS。另一种常用的缓冲液体系（Schaegger体系）（Schaegger,H.and van Jagow，G.,（1987）Anal.Biochem.166,368-379）为：浓缩胶缓冲液含0.75MTris，HCl滴定到pH8.45；分离胶缓冲液含0.9MTris，HCl滴定到pH8.45；负极缓冲液为0.1MTris和0.1MTricine，含0.1%SDS。正极缓冲液为0.2MTris。其它缓冲液包括磷酸盐缓冲体系、Bis-Tris缓冲体系、Tris-乙酸体系、双甘氨酸肽-NaOH体系、PIPES-磷酸钠体系、HEPES/MOPS/MES/Bicine-NaOH体系、MOPS-KOH体系等。如要在非变性条件下分离蛋白质分子，则需在凝胶和缓冲液中忽略SDS。