[发明专利]一种培育转基因大米的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域中一种培育转基因植物的方法及其应用，特别涉及一种培育转基因大米的方法及其应用。 

背景技术

在生活中，转基因大米是最重要的粮食作物之一，是人类食物和营养的基本来源。目前全世界大米播种面积约 2 . 26亿公顷，总产量约 5 . 5 亿吨。 

发明内容

本发明的目的是提供一种简单、快速、实用的培育转基因大米的方法，利用该方法培育转基因大米不需经过组织培养和植株再生的过程。本发明所提供的培育转基因大米的方法，是通过农杆菌的介导将外源基因导入大米生长点，通过非组培遗传转化方法得到转基因大米。生长点可为根尖生长点、茎尖生长点，优选为茎尖生长点。所述遗传转化的外植体为大米种子 23 一 27  C 萌发 48 一 72 小时得到的茎尖生长点。本发明的方法与其它培育转基因大米方法的显著区别在于采用大米生长点作为农杆菌介导的遗传转化的外植体，而不是未成熟胚或胚性愈伤组织或悬浮细胞，不需经过组织培养和植株再生的过程，从根本上克服了由于大米基因型对转化后形成可育再生植株的限制。本发明通过对局部人工损伤的大米生长点采用真空渗入技术进行农杆菌介导的遗传转化，获得了表达报告基因的转基因大米，生长点转化率达到 60 一 70 % ，成苗率平均 90 % , T 。代种子卡那霉素抗性阳性率为 16 一 21 % , T ，代幼苗报告基因表达阳性率占所测植株的 81 ％。尤为重要的是克服了大米遗传转化的瓶颈问题一基因型的限制。本发明所试材料的品种包括大米金花、大米京 411 、大米 4071 ，均获得上述效果。本发明的方法转化效率高、操作简便、重复性好、不依赖于受体的基因型。本发明的方法可以培育出各种高产、优质和／或抗逆性强的大米新种质：非组培遗传转化方法可应用到其它受基因型限制大难以获得转基因植株的单子叶农作物中，可以培育高产、抗逆、优质的新型农作物。 

具体实施方式

实施例 l 、转基因大米的培育 1 、大米外植体的处理 ( 1 ）将金花、京 411 和京 4071 三种大米品种的大米种子用 10 ％的次氯酸消毒 5 分钟，再用 70 ％的乙醇处理 10 分钟，然后用无菌水冲洗 3 次。在一无菌大平皿中垫三层以无菌水浸湿的纱布，将经消毒处理的大米种子置于平皿中 25  C 黑暗中萌发 48 小时，得到待转化的大米萌发种子。 ( 2 ）在无菌条件下用解剖针将待转化的大米萌发种子胚芽鞘划开，尽量暴露其生长点，以便于外源基因的导入。 2 、转化用农杆菌的培养 ( 1 ）将过夜培养的农杆菌菌株 LBA4404 / 3301 ，其中含 CaMV 355 启动子驱动的 GUS 基因， lml 接种于 100ml 含链霉素 100 mg / L ，卡那霉素 50 mg / L 和利福平 50 mg / L 的 YEB 培养基中， 28OC , 300 rpm 振荡培养至菌液浓度为 0D6 。。。． = 0 . 7 。 ( 2 ）在转化前向菌液中加入乙酞丁香酮至 100 卿，继续在 28oc , 300 rPm 振荡培养 2 小时。将上述菌液分装于 50ml 的无菌三角瓶中，每瓶 20ml 。 3 、转化 ( l ）将步骤 1 的（ 2 ）中的大米生长点浸入步骤 2 的（ 2 ）中的菌液中，侵染 20 分钟后，置于负压条件下，真空度 0 . 04 Mpa ，渗透 10 分钟。 ( 2 ）真空渗透处理后，倒除菌液，用无菌吸水纸将大米外植体表面的菌液吸净，转入含梭节基青霉素的 MS 培养基中， 22 一 25OC 、 16 / 8 小时光周期下共培养 3 天。