[发明专利]口服降血糖重组人胰岛素原的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及表面展示外源蛋白的重组芽孢的制备方法及产品，具体指的是在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示带有肠激酶标签的人胰岛素原HPI重组芽孢，属于重组融合蛋白药物技术领域。

背景技术

人胰岛素原(human proinsulin,HPI)是由109个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子量约为12kD（Bell GI，et al.1979.Kyriazis GA，et al.2012），等电点在5.2左右。HPI是人体唯一降血糖激素胰岛素的前体蛋白，体内和体外的研究均发现其能够有效降低胰高血糖素刺激的糖原分解，并结合胰岛素受体发挥生物效应。人体内胰岛素水平的长期失衡容易引起糖尿病，随着人类社会的不断发展和人民生活水平的不断提高，糖尿病的患者人数也在不断上升，其中中国已经成为世界上糖尿病患者最多的国家，2008年的流行病学分析显示全国的总患病人数约为9200万人，它被认为是二十一世纪威胁人类健康的沉默杀手。治疗糖尿病患者的方法主要是胰岛素的静脉注射（胰岛素注射液，商品名为诺和灵，诺和诺德生物制药公司生产http://www.novonordisk.com；胰岛素的注射药来得时，赛诺菲集团生产http://www.sanofi.cn/l/cn/zh/index.jsp），其给患者带来了极大的精神痛苦，也容易引起高胰岛素血症、体重增加和低血糖等并发症，并且糖尿病患者的治疗费用昂贵（美国每名糖尿病患者的年治疗费用达11744美元），因此越来越多的研究开始专注于口服降血糖药物的开发，目前中国的上市公司通化东宝正在进行口服胰岛素胶囊的二期临床开发（通化金马http://125.35.24.210/cpi/jsp/preview_1.jsp?TID=20080505093125243274372），其胰岛素的成分主要是发酵重组胰岛素获得。胰岛素的生产早期主要是从动物的胰腺中纯化结晶获得的，到了二十世纪九十年代才开始了世界范围内的重组胰岛素制剂的研制，但是其生产工艺复杂且产量较低，很难满足目前市场上对胰岛素制剂的需求（每年大约有几百亿美元的市场价值），其中胰岛素原的生产就是严重制约胰岛素制剂规模化的瓶颈。胰岛素原对肝代谢有较强的选择性作用，能够有效抑制肝葡萄糖的输出作用。利用胰岛素原的灌注实验发现其灭活时间远长于胰岛素，许多研究者认为可将其作为活性胰岛素来治疗糖尿病，临床实验也发现给2型糖尿病人注射胰岛素原，可控制空腹血糖含量，且很少发生低血糖。目前已有通过基因工程的方法用酵母发酵生产重组人胰岛素原，2010年德国亥姆霍兹中心感染研究所公布其毕赤酵母分泌发酵方法http://www.helmholtz-hzi.de/en/news_events/news/view/article/complete/new_pathway_to_cheap_insulin/，但要实现药物级重组人胰岛素原的大规模生产，发酵法仍然有许多的缺点和不足，因为重组人胰岛素原产品对纯度要求极高，纯度要求达到99.999999%以上，任何微量的杂蛋白都可能造成严重的免疫反应。这使得发酵法生产重组人胰岛素原的分离纯化方法和步骤复杂，生产成本较高。