[发明专利]一种从堆肥中快速、高效筛选拮抗细菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术和生物防治领域，具体涉及一种从堆肥中快速、高效筛选拮抗细菌的方法。

背景技术

土传病害是一种危害极其严重的植物病害。大量施用化肥，土壤连作，管理不当等都容易造成土传病害的爆发。病原菌通过侵入植物根部或茎部，引起植物死亡，造成重大的经济损失，据联合国粮农组织统计，每年因遭受植物病害引起的减产损失为总产量的10%~15%。因而对土传病害防治的研究一直是一个热点和难点课题。传统的化学农药防治虽然能使农业生产的集约化种植中出现的大规模发病的问题在短时间内得到解决。但从长远来看，化学农药的长期使用会带来诸多负面的影响。如药剂残留造成水源土壤的污染，危害人畜健康，长期使用农药病原菌容易产生抗药性，导致防效下降甚至失败。大量研究结果表明生物防治具有对环境和人畜安全、不易产生抗药性等优点，是一种经济有效的防治植物病害的方法，具有广阔的前景。因而寻求新的、高效的可替代化学试剂的生物生防资源，对农业的可持续性发展具有重要的意义。

堆肥（compost）是指在自然或人工强化接种微生物的情况下通过高温发酵使有机物矿质化、腐殖化和无害化变成腐熟肥料的过程。在堆肥过程中会产生各种营养类型的微生物群落，已有的研究表明这些丰富的微生物资源库，也是一个潜在的生防菌库。从堆肥中成功分离出诸如芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、克雷伯菌、木霉菌等拮抗菌用于土传病害防治的报道屡见不鲜。但从堆肥中筛选拮抗细菌普遍采用的方法，与从土壤中筛选拮抗细菌普遍使用的方法类似。大体上都是先将堆肥制成堆肥悬浮液，而后将悬浮液等梯度稀释后，用涂布棒均匀涂布到适合细菌生长的酵母膏蛋白胨培养基(LB)或大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)上，待涂布后的培养基长出菌落后，将菌落划线纯化，挑选形态不一样的单菌落在适合真菌生长的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上采用对峙培养或点接法一一进行拮抗实验。由于堆肥或土壤中含有的细菌数量繁多，涂布纯化后长出的单菌落也成百上千，没有针对性的一一挑选进行拮抗实验，造成了很多繁琐和重复的工作，且需要消耗大量的培养基和培养皿。工作量大、效率低是上述方法的最大缺点。

发明内容

本发明的目的在于针对用传统的稀释平板涂布法从堆肥中筛选拮抗细菌工作量大、效率低这一问题，通过建立一种高效、快速的从堆肥中筛选拮抗细菌的方法，以达到减少筛选工作量、缩短筛选时间，加快拮抗菌的开发和应用，促进我国生物防治和可持续农业的发展目的。

本发明的技术方案如下：

一种从堆肥中快速、高效筛选拮抗细菌的方法，其特征在于按照以下几个步骤进行： 

（1）拮抗菌的初筛：将堆肥悬浮液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上后再直接涂布致病菌孢子悬浮液，使细菌与致病菌直接对峙，优选制备重量百分比为10%堆肥原液后，依次制备稀释度为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6的堆肥悬浮液，堆肥悬浮液涂布的量为100 μl，致病菌孢子悬浮液涂布的量为200 μl，浓度为l×10⁶CFU/ ml。

（2）目标细菌的纯化：待平板上形成抑菌圈后，从抑菌圈内将混合的目标细菌进行划线，纯化，优选纯化直至每个培养皿中细菌菌落的形状、大小和颜色相同。

（3）拮抗细菌的复筛：采用平板对峙法将纯化的目标细菌的菌液分别点接到含有病原菌的平板上，通过观察抑菌圈的有无，筛选出拮抗菌。

本发明所述的筛选出拮抗细菌的方法，具体可按照下述步骤进行：

一、拮抗细菌的初筛

（1）配制固体马铃薯葡萄糖培养基（马铃薯200 g/L，葡萄糖 20 g/L，琼脂20 g/L）。

（2）称取10 g堆肥，加入含有90 ml无菌水的500 ml的三角瓶中，充分振荡后将三角瓶置于37℃的摇床中200 r/min，摇瓶30 min。

（3）吸取5 ml上述步骤制备的堆肥悬浮液加到含有45ml无菌水的150ml的三角瓶中，制成10^-2的堆肥悬浮液，混合均匀。再如此依次配制10^-3，10^-4，10^-5，10^-6的系列堆肥稀释液。

（4）用移液枪分别吸取上述系列堆肥稀释液100 μl，滴在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，然后用涂布棒将其均匀涂布。