[发明专利]用于快速检测ATP的荧光共振体系的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和快速诊断检测领域，特别涉及用于快速检测ATP的荧光共振体系的制备方法，适用于低浓度ATP的快速检测以及细胞生物学线粒体功能等方面的应用。

技术背景

三磷酸腺苷(ATP)存在于从微生物到高等动植物细胞所有的生物体中。ATP在细胞体内主要作用是提供能量，参与体内脂肪、蛋白质、糖和核酸的代谢，是机体能量的重要来源，在维持生物体的正常机能上有着无可替代的作用。ATP作为最重要的能量分子在细胞的各种生理、病理过程中起着重要作用，可作为细胞活性的一个重要标志物。ATP也常作为微生物污染的一个指标，通过检测ATP含量，可以检测食品、水、啤酒、药品、化妆品等样品中的微生物含量，从而反应出其受污染的程度。线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成ATP的主要场所，通过监测活细胞线粒体内ATP含量的改变，可以评价多种药物、生物制剂或生物活性物质引起的细胞杀伤、细胞抑制和细胞增殖作用。

传统的ATP检测方法有生物发光法、高效液相色谱法和同位素示踪法等。其中高效液相色谱法操作复杂且检测时间较长；同位素示踪法虽检测灵敏度较高，但污染较大限制其应用。采用生物发光方法是目前较为流行的方法之一，该方法基于萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）催化荧光素氧化，消耗ATP，发出光子的高效发光反应，具有发光效率极高、发光量与ATP含量呈很好的线性关系的特点，而ATP含量是萤光素氧化反应中的限制因素，光的强度与样品中所含的ATP量成正比，需利用高灵敏度的仪器测定光的强度进行定量分析。而目前众多的ATP检测方法多适用于体外ATP检测，对活细胞线粒体内ATP的检测涉及较少。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足、提高ATP检测的灵敏度以及实现对细胞内ATP的适时监控，本发明的目的在于提供用于快速检测ATP的荧光共振体系的制备方法，利用ATP与其配体链（aptamer)的特异性结合原理，利用荧光能量共振转移技术，通过检测QDs与配对荧光染料的荧光强度比值变化，实现对ATP的快速检测。

为实现上述目的，本发明通过以下的技术方案实现，

用于快速检测ATP的荧光共振体系的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：准备一种Cy3荧光标记的ATP-aptamer适配体，ATP-aptamer适配体为3’-Cy3修饰的DNA适配体，其序列信息为：5’-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-Cy3-3’；

步骤二：将QDs与ATP-aptamer适配体互补链进行偶联反应，得到QDs-分子探针，QDs为羧基表面水溶性量子点（COOH-QDs），浓度为1uM；ATP适配体互补链为5’-NH₂-(CH₂)₁₂修饰的DNA，其序列信息为：5’-NH₂-(CH₂)₁₂-ACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGT-3’（Probe DNA，DNAp）；

步骤三：将步骤2得到的QDs-分子探针与Cy3荧光标记的ATP适配体反应，得到ATP适配体与互补链相互作用后的用于检测ATP的荧光共振体系。

本发明采用能量共振转移原理，以带有荧光染料Cy3标记的ATP适配体与量子点标记的ATP适配体互补链，通过杂交反应形成双链，构建能量共振转移体系。利用ATP与ATP适配体特异性识别结合的原理，以量子点为能量供体，Cy3为能量受体进行能量共振转移，检测荧光信号强度比值改变。在无ATP存在的条件下，与QDs偶联的ATP适配体互补链与Cy3标记的ATP适配体形成双链进行能量转移，QDs荧光下降，Cy3荧光增强；当有ATP存在时，ATP与ATP适配体特异性识别，双链解体，能量共振转移体系降低或消失，QDs荧光增强，Cy3荧光降低，从而实现对ATP的快速检测。

本发明利用了ATP与其配体链(aptamer)特异性结合的特点，结合能量共振转移技术，实现了对ATP的快速检测，为ATP的体外检测监控提供了一种新的方法

本发明设计了一种快速、高灵敏度检测ATP的体系。以QDs标记的DNA-aptamer为分子探针，利用荧光能量共振转移原理，通过检测QDs与配对荧光染料的荧光强度比值变化，从而实现对ATP进行定量检测，可以提高ATP检测灵敏度、缩短检测时间，降低成本。

附图说明

图1为偶联反应原理示意图。

图2为荧光共振体系反应原理示意图。