[发明专利]猪β2肾上腺素受体融合蛋白及其编码基因和表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和生物工程技术，尤其是涉及一种猪β₂肾上腺素受体融合蛋白及其编码基因和利用家蚕生物反应器表达猪β₂肾上腺素受体融合蛋白的方法。

背景技术

β₂肾上腺素受体激动剂（简称β₂激动剂或β₂兴奋剂，俗称瘦肉精）能促进动物的营养物质重新的分配，具有促进蛋白质合成、降低脂肪沉积、提高瘦肉率、降低饲料成本等作用，常被用作生长促进剂而添加动物饲料中(V Tsatsaris et al,Obstetrics & Gynecology，2001,97(5):840-847)。β₂激动剂的使用能让猪的瘦肉率提高、带来更多的经济价值，但会直接影响到动物肉类产品的品质，从而危害到人类的生命安全。瘦肉精的非法滥用一直是畜产品安全问题的焦点之一。

β₂激动剂属于小分子药物，它的作用机理是通过与细胞膜上β₂肾上腺素受体（β₂-Adrenergic receptors，简称β₂AR）结合启动一系列生理生化反应。主要途径为药物通过作用于细胞膜上的β₂肾上腺素受体，使其第三内环构象发生改变，刺激受体与鸟苷酸结合蛋白（G蛋白，G Protein）发生偶联，从而激活G蛋白与腺苷酸环化酶的偶联，腺苷酸环化酶将三磷酸腺苷转化为3,5－环磷酸腺苷（cAMP），从而诱发体内的一系列反应。激活的β₂AR会产生以下效应：心率加快，支气管、子宫和肠道平滑肌松弛，促进胰岛素释放和糖原分解等。β₂AR是一种可以识别各种β₂激动剂的蛋白，其与β₂激动剂的结合具有特异性和高亲和性。目前市场上通用的检测β₂激动剂的方法是利用抗体采用酶联免疫法的检测技术，但这种方法的一种抗体只能针对一类药物，因此将β₂AR用来检测所有这一类β₂激动剂药物将有广泛的应用前景。

另一方面，在人工体外表达β₂AR方面。Munch等利用大肠杆菌对G受体蛋白偶联受体进行原核表达时，虽然具有较大的蛋白表达量，但表达产物由于缺乏糖基化、乙酰化等修饰而造成其相对活性较低(Munch G.et al,Receptors Channels,1995,3:291-297.);而利用酵母表达系统表达G受体蛋白偶联受体虽然具有较好的生物学活性，但其蛋白表达量较低，在毕赤酵母中的ɑ₂肾上腺素受体的表达量为20-30mg活性蛋白/15L培养基(Sizmann D.et al,Receptors Channels,1996,4:197-203)。

而杆状病毒表达系统这一生物反应器是八十年代建立起来的。自从1983年首次利用杆状病毒系统高效表达了人的a-干扰素以来（Smith,Mol.Cell.Biol.,3:1983:2156-2165），已有数十个外源基因得到了高效表达。但采用该表达系统并应用家蚕或蚕蛹来进行外源基因表达，尤其是用来表达β₂AR却未有先例。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪β₂肾上腺素受体融合蛋白及其编码基因，以及利用杆状病毒表达系统，尤其是家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统高效表达、生产β₂肾上腺素受体的方法。

本发明提供了一种猪β₂肾上腺素受体融合蛋白A，其氨基酸序列包含有猪β₂肾上腺素受体蛋白序列，同时，在猪β₂肾上腺素受体蛋白序列N端去掉起始密码子并添加有信号肽序列，所述信号肽优选为gp64；并在猪β₂肾上腺素受体蛋白序列C端的终止密码子之前添加有3×Flag标签蛋白序列。

本发明的上述所述猪β₂肾上腺素受体融合蛋白A，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种编码上述所述的猪β₂肾上腺素受体融合蛋白A的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了一种质粒，所述质粒含有上述所述的编码融合蛋白A的基因，所述质粒优选为Bacmid。