[发明专利]多级PCR反应系统及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物和检测领域，具体地，本发明涉及新颖的多级PCR系统及其应用。

背景技术

PCR是涉及通过多个循环，指数扩增某种多核苷酸序列的技术。PCR技术是众所周知的，并且已经被广泛使用。

PCR技术一般包括以下步骤：变性多核苷酸，然后将至少一对引物寡核苷酸退火到变性的多核苷酸上(使引物与变性的多核苷酸模板杂交)。退火步骤之后，具有聚合酶活性的酶，使用最初的变性多核苷酸作为合成模板，催化合成一条新的掺入了引物寡核苷酸的多核苷酸链。这一系列步骤(变性、引物退火和引物延伸)构成一个PCR循环。

随着循环的重复，新合成的多核苷酸的量指数增加，因为由较早循环新合成的多核苷酸可用作后续循环的合成模板。

DNA的变性一般发生在约90-95℃，引物一般在约40-60℃退火至变性的DNA，用聚合酶延伸退火的引物的步骤一般在约70-75℃进行。因此，在PCR循环中，必须改变反应混合物(反应体系)的温度，在多循环PCR实验中要多次改变。

PCR技术具有广泛的生物学应用，包括例如，DNA序列分析、探针产生、克隆核酸序列、定位诱变、检测基因突变、诊断病毒感染、分子“指纹分析”和监测生物液体和其他来源中的污染微生物。

多重PCR(multiplex PCR，又称多重引物PCR或复合PCR)，是在同一PCR反应体系里加入两对或两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。

多重PCR技术已被广泛应用于核酸诊断的许多领域,包括基因敲除分析、突变和多态性分析、定量分析及RNA检测等。在感染性疾病领域，多重PCR技术已经显示出它的价值，成为识别病毒、细菌、真菌和寄生虫的有效方法。利用一次多重PCR反应，可同时检测、鉴别出多种病原体，在临床混合感染的鉴别诊断上具有其独特的优势和很高的实用价值。

然而，在实际应用中，无论的常规PCR反应还是多重PCR反应体系，如果环境或操作过程中引入极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果。为了防止污染，一些实验不得不在高度洁净的操作设备或操作室进行。

在PCR反应过程中，各种试验条件控制不当很容易导致扩增失败，降低其灵敏度和特异性。

此外，现有PCR技术能够检测的灵敏度还难以令人满意，尤其是在对含量极低的核酸样品(如仅含1-10个拷贝目标序列的样品)。在活检、尸检样品中检测病原体(如HPV)时，因无关核酸物质的存在，检测灵敏度一直难以提高。

综上所述，目前还缺乏在封闭反应体系中，对PCR扩增产物简便有效地进行定量或半定量转移的方法。

因此本领域迫切需要开发一种灵敏度高、特异性好、抗干扰能力强的HPV型别的鉴定方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种灵敏度高、特异性好、抗干扰能力强的PCR反应设备和方法。

本发明的第一方面，提供了一种多级PCR反应管，所述反应管包括二个或多个可封闭的PCR反应腔或隔室(10)(compartment)，并且在至少两个隔室之间设有封闭的或可封闭的连接通道(40)，所述连接通道用于让携带PCR扩增产物的固体颗粒(50)从一个隔室(或上游隔室)转移至另一隔室(或下游隔室)。

在另一优选例中，所述的反应管包括n个隔室，其中n为2-5000的任一正整数；较佳地，n为2-500的任一正整数。

在另一优选例中，所述的反应管包括M个多级组，各多级组分别具有2、3、4或5个相互连通的隔室，其中M为1-1000的任一正整数。

在另一优选例中，M为192、96、48、24、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1。

在另一优选例中，所述的PCR反应管的隔室呈直链构型、支链构型、或环形构型。较佳地，呈“一”字构型、“V”字构型、或“□”或“○”字等构型。

在另一优选例中，所述的各隔室为串联设置。

在另一优选例中，所述的隔室呈矩阵排列，所述矩阵为a×b矩阵，其中a为2-100的正整数，b为2-100的正整数。

在另一优选例中，所述的矩阵为6×8、6×16、8×12、12×16矩阵。

在另一优选例中，所述的隔室具有腔盖(20)，并且对于相互连通的多个隔室而言，当各自的腔盖全部盖上后，就构成一个封闭空间。

在另一优选例中，所述腔盖为密封盖。

在另一优选例中，所述腔盖与隔室是一体化的；更佳地，上述腔盖通过连接件(22)与隔室腔体连接。