[发明专利]一个水稻组成型启动子功能区域的鉴定及应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及一个水稻组成型启动子鉴定及应用。 

背景技术

高等生物的生长发育是不同基因在不同的时间和空间上有序表达和协同作用的过程，在此过程中基因的表达情况(开启、关闭、表达部位、表达时间、表达量的高低)都是受到惊喜的调控的。基因表达的调控可以分转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平四个层面上的调控方式，其中转录水平的调控最经济、灵活，又是最为重要和复杂的调控。因此与转录水平相关的顺式因子称为启动子(指RNA聚合酶特异性识别并与之结合从而起始转录下游基因的一段DNA序列)，它控制了基因表达的时间、组织及表达量的高低。而启动子是在转录水平上调控基因表达最重要的顺式元件之一，它与RNA聚合酶以及其他作为反式元件的蛋白辅助因子之间的相互作用是启动子调控模式的实质。植物启动子，根据其驱动的基因的表达情况的不同可以分为组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子。另外还有双向启动子和可变启动子这两类较特殊的启动子。但这种分类只是相对的，在特定的情况下，有些启动子往往也兼备其它类型启动子的特性。启动子作为在转录水平上调控基因表达重要的调控元件，是许多转录因子和RNA聚合酶作用的靶标，因此深入研究启动子的结构、功能区域、作用模式及其功能等对于回答生物学中一些基本理论问题具有重大意义。 

在植物基因工程中，根据外源基因表达的需要，如果需要外源基因在植物中能够持久、稳定、高效地表达，使外源基因表达的产物充分发挥其功能或研究基因的功能时，一般都使用组成型启动子。组成型启动子驱动外源基因在植物各个组织均表达，但是在具体的应用中逐渐暴露出一些问题，如外源基因的表达具有持续恒定表达的特性，会过度消耗植物体内的营养物质和能量，从而对植物的营养物质的吸收带来巨大压力，同时也会产生许多异源蛋白和代谢物质，但是这些产物对受体植物可能是不需要的，有的可能是有毒的，进而会影响到植物的正常生长发育，严重时将导致死亡(Ehsani et al.，2003；Miyao and Fukayama，2003；。而同时使用同一个启动子驱动多个外源基因可能就会引起基因沉默或者共抑制等现象(Kumpatla et al.，1998)。目前在植物基因工程中广泛应用的组成型启动子主要来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子、根癌农杆菌Ti质粒的胭脂碱合成酶基因NOS启动子、水稻Actl启动子和玉米泛素蛋白Ubiquitin启动子。植物基因工程中应用最为广泛的组成型启动子为完整的35S启动子，它在转基因水稻、拟南芥、马铃薯、小麦等高等植物研究中都有广泛的应用。在植物基因工程中应用从病毒中克隆出来的启动子序列，可能存在潜在的生物不安全性，因此，从植物克隆活性强的内源型组成型启动子非常重要。 

真核生物RNA聚合酶有三种，因此与之对应的启动子有三类，I型启动子主要用来转录5srDNA，需要通过通用转录因子(TFIIA，TFIIB和TFIIC)的结合来定位RNA聚合酶。II型启动子主要用于tRNA基因的转录，但是需要通过TFIIB和TFIIC的结合来定 位RNA聚合酶。III型启动子主要用于scRNA基因的转录，则需要TFIIB和其他的辅助因子的参与(魏晶，2011)。其中II型启动子为最主要的启动子，其基本结构如图1所示。 

基本启动子是RNA聚合酶结合的位点，因此它决定基因转录的起始(Juven-Gershon et al.，2006)。基本启动子包括两个保守的结构，一是转录的起始位点(initiator.简写为Inr)，即为前体mRNA帽子位点。转录的起始位点两侧的序列相对比较保守，通常表示为PyPyANPuPy，其中Py代表嘧啶，Pu代表嘌呤，N代表任意碱基，A为起始位点(+1)(Juven-Gershon et al.，2008)。另一个共同的保守结构是位于转录起始位点上游-25～-30为中心的7bp左右的共同序列为TATAAAA(非模板链的序列)的保守区域(TATAbox)，该保守区域的第5、7位的A常常被T取代，因此保守序列的碱基频率是T95A87T93A85A63A83A50(杨歧生等，2003)。而TATA box和Inr之间的核苷酸序列对转录的速率有重要的影响，虽然它不会改变转录的起始位点，但是这两个保守序列之间的距离对精确的转录起始非常重要，如果延长或者缩短两元件间的距离则可能导致转录活性的丧失(Zhu et al.，1995)。