[发明专利]一种鸭疫里默氏杆菌二价复合佐剂灭活疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种鸭疫里默氏杆菌二价复合佐剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于其制备方法及步骤如下：

（1）制备种子液：将沃华研发中心保种的鸭疫里默氏杆菌2型GD-2株和沃华研发中心保种的鸭疫里默氏杆菌10型GN19株分别接种于改良酵母琼脂血平板进行培养，在37℃下培养24小时，挑取单菌落于改良酵母琼脂血平板纯化一代，选5～10个典型菌落接种于改良酵母液体培养基，在37℃下振荡培养24小时，得到种子液，用显微镜进行纯粹检验，将检验合格的作为种子，放入冰箱于2～8℃下保存备用；

（2）制备制苗用菌液：在改良酵母液体培养基中接入步骤（1）得到的保存不超过7天的种子液，接入量为液体培养基量的2%～5%，37℃下培养8～12小时，对菌液进行检验提纯，选取活菌数不低于2×10¹⁰CFU/ml的菌液；

（3）灭活：将步骤（2）得到的制苗菌液中加入菌液量0.3%的甲醛溶液，在37℃下灭活24～48小时，然后进行活菌检验，至无活菌生长；

（4）制备复合佐剂：取占最终疫苗质量15%的氢氧化铝胶，用生理盐水溶解，将杨树皮类脂和免疫增强剂按比例加入，其中杨树皮类脂佐剂加入量为最终疫苗质量的4-6%，免疫增强剂用量为最终疫苗质量的1-3%，用均质机混合均匀，即得免疫复合佐剂；

（5）制备疫苗：将步骤（3）得到的制苗的灭活菌液与免疫复合佐剂混合，以3000rpm转速搅拌30分钟，运行完毕，疫苗降温至室温，分装，得到疫苗成品。

2.根据权利要求1所述的一种鸭疫里默氏杆菌二价复合佐剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述的改良酵母液体培养基组成成分为牛肉膏、蛋白胨 、水解乳蛋白、酵母浸粉、氯化钠，其中制作方无法为各成分按重量百分比牛肉膏︰蛋白胨︰水解乳蛋白︰酵母浸粉︰氯化钠为3～5%︰3～5%︰3～5%︰2～3%︰2.3～3.5%，用蒸馏水溶解，并定容，pH值调整为7.2，在116℃下灭菌30分钟制成。

3.根据权利要求1所述的一种鸭疫里默氏杆菌二价复合佐剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤（5）中灭活菌液与免疫复合佐剂的混合比例，根据每次培养的细菌中抗原的含量而定，使最终疫苗中抗原含量：2型抗原为35亿/ml，10型抗原为50亿/ml，铝胶15%，类脂5%，免疫增强剂2%。