[发明专利]一种用于小RNA转染的重组融合蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组融合蛋白，具体地涉及一种用于小RNA转染的重组融合蛋白；此外，本发明还涉及该重组融合蛋白的制备方法。

背景技术

1、siRNA

RNA干扰（RNA interference，RNAi），是将与特定mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，dsRNA经酶切后会形成很多小片段，称为小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)，这些小片段与mRNA中的同源序列互补结合后，会导致mRNA失去功能，也就是使基因“沉默”。

siRNA最早是由英国的David Baulcombe团队发现，是植物中的后转录基因沉默（post-transcriptional gene silencing；PTGS）现象的一部分，其研究结果发表于《科学》。2001年，Thomas Tuschl团队发现合成的siRNA，可诱导哺乳动物体内的RNA干扰作用，结果发表于《自然》。这项发现引发了利用可控制的RNA干扰作用，来进行生物医学研究与药物开发的方法。

目前用于siRNA转染的主要有磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法、阳离子脂质体试剂等。其中电穿孔法、机械法、DEAE-葡聚糖和polybrene只适合用少量的细胞体外转染，磷酸钙共沉淀对于实验技术要求极为苛刻，阳离子脂质体试剂通常只用于大片段的DNA质粒的转染，并且对细胞具有很高的毒性，需要在转染后更换培养基去除脂质体。用于哺乳动物细胞转导siRNA的高效、低毒、简便的方法尚需进一步探索，目前还没有通过使用蛋白质介导转入DNA或RNA等核酸分子的报道。

2、蛋白质的转导

蛋白转导最初来自于对HIV TAT蛋白的研究，人们发现全长HIV TAT蛋白能够进入细胞激活病毒基因的转录。进一步研究表明，HIV TAT蛋白的一个区域（TAT PTD）负责进入细胞的功能。人们发现将TATPTD与大分子偶联或融合能将大分子的蛋白送入细胞。研究表明带正电荷的精氨酸对于TATPTD穿膜进入细胞质是必须的，任何一个精氨酸的突变都会导致转导功能的丧失。在此基础上，人们发现多聚精氨酸同样具有转导的功能。利用TATPTD和其他蛋白转导多肽的蛋白质转导技术在解决大分子药物进入细胞发挥功能方面具有巨大的潜力。

3、双链RNA结合蛋白

双链RNA结合蛋白（dsRNA-binding protein,dsRBP）是一类含有dsRNA结合域（dsRNA-binding domain,DRBD）的蛋白质，广泛存在于真核细胞、细菌、病毒中，参与从RNA加工到翻译的调控等过程。根据有无催化结构域，可将dsRBP分为两类。一类是含有催化结构域的dsRBP，如作用于RNA的腺苷酸脱氨酶、双链RNA依赖的蛋白激酶等。另一类不含催化结构域，如TAR RNA结合蛋白、非洲爪蟾RNA结合蛋白等。

DRBD的氨基酸序列具有种属保守性，一般有65-70个氨基酸残基组成，其结构一般为αβββα组成，能特异识别并结合dsRNA。根据与dsRNA亲和力的不同，可将DRBD分为A型和B型。通常情况下，A型比B型对dsRNA的亲和力高，A型的整个结构域都包含保守性的氨基酸残基，而B型只在C-端分布保守的氨基酸残基。在含有多个DRDB结构域的蛋白质中，DRBD之间存在相互协作的关系。例如前面的DRBD可将结构不规范的RNA矫正，从而使矫正后的RNA更易于同后面的DRBD结合，或通过改变同一蛋白质中的DRBD的距离，提高dsRBP与dsRNA的亲和力。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种用于小RNA转染的重组融合蛋白，该蛋白质能够特异性结合dsRNA，并介导通过细胞膜转入到细胞质中。此外，本发明还提供了该重组融合蛋白的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种用于小RNA转染的重组融合蛋白，该重组融合蛋白由具有转导功能的蛋白转导结构域（PTD）和具有与dsRNA结合功能的RNA结合域（简称dsRNA结合结构域，DRBD）构成，即PTD-DRBD。

所述重组融合蛋白的PTD为HIV TAT蛋白的TATPTD区域，或者其他具有蛋白转导功能的氨基酸序列；该蛋白的PTD使该重组融合蛋白能进入到细胞内。