[发明专利]一种从油菜叶中提取高纯度SOD的方法

说明书

技术领域

本发明提供一种从油菜叶中提取高纯度SOD的方法，属于食品深加工的领域。

背景技术

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶.它是一种源于生命体的活性物质，SOD是机体内危害最大的氧自由基专一清除剂，亦是其他自由基最有效的清除剂，它与体内的谷胱甘肽过氧酶、过氧化氢酶联手，把自由基转化为水和氧分子。能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充 SOD具有抗衰老的特殊效果。 

从植物，特别是人们日常经常食用的蔬菜、瓜果、野生植物及粮食中提取SOD，使用安全性非常高，避免了可能发生的交叉感染。利用全新的生物技术从植物中提取SOD，具有明显的社会和经济效益，市场前景广阔。从植物中提取SOD的主要传统工艺流程为:植物→打浆→超滤分离→有机溶剂去杂→柱层析精制→超滤浓缩→冷冻干燥→产品。

发明内容：

本发明提供一种从油菜叶中提取高纯度SOD的方法，该方法采用独有的磷酸钾缓冲液配方：50mmol/L的磷酸钾缓冲液，除含有磷酸钾外，还含有1mmol/L的EDTA、0.4mmol/L的蔗糖、0.01%巯基乙醇，且缓冲液的pH值为7.9；5mmol/L的磷酸钾缓冲液，除含有磷酸钾外，还含有1mmol/L的巯基乙醇，且缓冲液的pH值为7.9；并且优化了离子交换柱和凝胶柱分离的条件；通过该法可以获得纯度更高、成本更低的SOD。

本发明的技术方案：

A、取新鲜的油菜叶1重量份，加入2-3重量份50mmol/L的磷酸钾缓冲液中，搅打匀浆，用100-120目筛抽滤，将滤液以3000-5000转/分钟，离心16-25分钟获得叶绿体；

B、将A步骤所得叶绿体用0.2-0.3重量份50mmol/L的磷酸钾缓冲液冲洗两次；放入5mmol/L的磷酸钾缓冲液中，一边搅拌一边用超声波进行粉碎处理，经离心机4000-6000转/分钟，离心20-30分钟，获得上清液即为粗酶液；

C、向B步骤所得粗酶液中加入硫酸铵，直至硫酸铵的饱和度达到50-60%，静置2-4小时，经离心机4000-6000转/分钟，离心30-40分钟，取上清液；

D、向C步骤所得上清液中加入硫酸铵至饱和浓度为93-97%，静置2-4小时，经离心机4000-6000转/分钟，离心40-50分钟，所得沉淀物即为粗制的SOD；

E、将D步骤所得的粗制SOD，加入3-5倍体积的5mmol/L的磷酸钾缓冲液溶解并透析，将透析过的溶液通过低温真空浓缩至原体积的1/3-1/4；

F、将E步骤所得浓缩液经Sephadex G-75凝胶柱或DEAE- Sephadex A-50离子交换柱进行提纯；凝胶柱的洗脱液为5mmol/L的磷酸钾缓冲液溶；离子交换柱的洗脱液为5-300mmol/L的磷酸钾缓冲液溶，进行梯度洗脱；

G、将F步骤所得洗脱液经低温真空浓缩，然后冷冻干燥后即可获得高纯度的油菜叶绿体SOD。

其中，50mmol/L的磷酸钾缓冲液，除含有磷酸钾外，还含有1mmol/L的EDTA、0.4mmol/L的蔗糖、0.01%巯基乙醇，且缓冲液的pH值为7.9；5mmol/L的磷酸钾缓冲液，除含有磷酸钾外，还含有1mmol/L的巯基乙醇，且缓冲液的pH值为7.9。

本发明解决的技术问题：

1、采用了新的工艺流程，比传统工艺步骤少，设备简单，节约了成本，易于推广。

2、采用了独有的磷酸钾缓冲液配方，在提高了分离效率的同时对SOD的活性进行了很好的保护，保证了成品的质量。

3、对不同类型的柱子采用新的洗脱条件，提高了产品的活性和纯度，本发明可以将产品提纯150倍，传统工艺在100倍左右，而活性比传统工艺提高了10倍。

具体实施方式

实施例1：

A、取新鲜的油菜叶100公斤，加入200公斤50mmol/L的磷酸钾缓冲液中，搅打匀浆，用100目筛抽滤，将滤液以3000转/分钟，离心25分钟获得叶绿体；

B、将A步骤所得叶绿体用20公斤50mmol/L的磷酸钾缓冲液冲洗两次；放入5mmol/L的磷酸钾缓冲液中，一边搅拌一边用超声波进行粉碎处理，经离心机4000转/分钟，离心30分钟，获得上清液即为粗酶液；

C、向B步骤所得粗酶液中加入硫酸铵，直至硫酸铵的饱和度达到50%，静置2小时，经离心机4000转/分钟，离心40分钟，取上清液；