[发明专利]河豚毒素中和性单抗杂交瘤细胞5E7及其轻、重链可变区基因与应用

说明书

应用技术领域

本发明涉及一株河豚毒素中和性单抗杂交瘤细胞(命名为5E7)的制备，具体涉及河豚毒素中和性单抗杂交瘤细胞株的构建和单抗编码基因的钓取，还涉及其应用。

背景技术

河豚毒素(Tetrodo toxin，TTX)是一种重要的海洋生物毒素，广泛存在于海洋生物和陆栖等众多生物中，并可通过食物链富集等途径污染其它水产品。TTX中毒屡有发生，死亡率达40％以上。作为一种潜在的军用毒剂，TTX已被列入国际生物安全公约清单。目前针对TTX中毒，国内外还没有适用于人体的专用特效药，因此迫切需要建立和发展具有自主知识产权的以抗体为基础的检测和防护用品。

发明内容

本发明的主要内容有以下4个。

1.抗河豚毒素单抗杂交瘤细胞株的构建

1.1免疫抗原的制备：河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)15mg溶于pH5.0的柠檬酸缓冲液中，将此溶液缓慢滴加到15mg KLH/0.01M PBS溶液中，边加边搅拌，调pH值到7.0，冰浴下加入1％戊二醛3ml，室温反应1.5小时，用0.01M PBS 4℃进行透析两天，期间多次换液，离心去除变性蛋白，检测蛋白定量，既得TTX-KLH复合物即免疫原，分装10支，1mg/支，-20℃以下保存。

1.2检测用抗原的制备：河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)10mg溶于pH5.0的柠檬酸缓冲液中，将此溶液缓慢滴加到10mg BSA/0.01M PBS溶液中，边加边搅拌，调pH值到7.0，冰浴下加入1％戊二醛3ml，室温反应1.5小时，用0.01M PBS 4℃进行透析两天，期间多次换液，离心去除变性蛋白，既得TTX-BSA复合物即免疫原，分装20支，0.4mg/支，-20℃以下保存。

1.3抗TTX单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建、筛选和鉴定：选用4-6周龄的雌性Balb/c小鼠6只，分别用12.5μg TTX-KLH对小鼠腹股沟皮下多点注射免疫，每三周免疫一次，共免疫4次，常规方法融合。用TTX-BSA间接ELISA筛选，阳性细胞反复亚克隆直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100％阳性。于Balb/c小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水，ProteinA SepharoseCL4B亲和柱纯化，SDS-PAG、间接ELISA鉴定。

2.抗TTX单抗的中和活性测定：选用4-6周龄的昆明小鼠100只，雌雄各半，将TTX用双蒸水溶解，原液浓度为1mg/mL，用常规实验方法检测TTX的LD50。先将1mg/mL的单抗(对照组用蒸馏水)注入小鼠腹腔，然后注入1.62μg/ml TTX溶液，动态观察并记录小鼠的生存状态2周。

3.杂交瘤细胞5E7轻、重链基因的钓取：取对数生长期的中和性单抗5E7细胞，用TRIzol提取RNA(图1)，经RT-PCR，用两对特异性引物PHs1，PHs2；PLs1、PLs2钓取抗体的轻重链基因(图2)。常规法连接入PGEM Teasy载体，转化感受态细菌JM109，于固体LB平板37℃孵箱12～18小时后挑取单个菌落，提取质粒PCR鉴定后进行DNA测序分析。

4.单抗5E7轻、重链可变区基因序列和氨基酸序列的确定：用www.expasy.org在线软件将核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列。根据Kabat数据库确定轻链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。重链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。

附图说明

图1.两株TTX单抗的检测结果

图2.TTX单抗杂交瘤细胞染色体核型分析结果

图3.TTX中和性单抗5E7杂交瘤细胞RNA提取结果

图4.TTX中和性单抗5E7杂交瘤细胞轻重链基因的PCR结果1为轻链基因；2为DL2000；3为重链基因，基因大小大约为660bp。

具体实施方式通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明，并不意味着限定本发明的范围。

实施例一抗TTX单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建