[发明专利]蟹类抗体谱检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及酶免疫印迹技术，具体是一种检测蟹过敏患者血清特异性IgE（sIgE）抗体谱检测试剂盒。

背景技术

食物过敏的本质是一种错误的免疫应答，机体对某种食物过敏时，会在体内产生相应的特异性抗体（IgE和IgG），这种抗体对自身造成损伤引起过敏反应，临床可以表现为皮肤、呼吸道、消化道症状，甚至危及生命。早期对于食物过敏的检测，主要集中在病史观察及体内试验（如皮肤点刺试验、食物激发试验）；但这些方法不仅昂贵、耗时，并且存在着诱发严重过敏反应的风险，已渐渐被淘汰。目前，临床上常采用检测特异性抗体来确定患者食物过敏情况，最终确定过敏食物。

采用体外检测蟹类特异性抗体具有不受药物干扰、安全无风险、患者容易接受等优点。特异性IgE测定基于免疫化学原理，即通过已知蟹蛋白（过敏原）测定未知抗体（IgE）。如血清中检测到针对蟹蛋白的抗体，即可以判断检测对象对蟹过敏。血清特异性IgE需要采用标记免疫技术，通常使用酶、荧光物质等作为标记物，即酶联免疫吸附试验、酶免疫印迹法以及荧光酶免疫法。无论采用何种标记技术，均有优质的已知抗原为基础，包被抗原的质量直接影响检测结果。

现有诊断试剂盒多采用从食物中提取的总蛋白成份作为已知抗原，一般不对总蛋白进行细分，也不考虑各组份之间的比例关系。基于食物总蛋白提取物作为包被抗原，检测特异性IgE的食物过敏原诊断试剂盒均存在如下缺陷或不足。以蟹为例：食物过敏反应存在明显个体差异，不同过敏患者血清中特异性IgE存在明显个体差异；换句话说，蟹过敏患者血清中特异性IgE的种类和浓度存在一定差别，而这种差别对临床诊断和治疗有重要指导意义。现有食物过敏原试剂盒由于采用总蛋白进行包被，不能对特异性IgE的异质性进行区分。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种多组分的特异性IgE联合测定的蟹类抗体谱诊断试剂盒，解决目前蟹特异性诊断试剂盒只能筛选出血清中蟹特异性IgE的存在，而不能确定患者对蟹中不同过敏蛋白的差异。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种蟹类抗体谱检测试剂盒，包括显色底物、印记反应槽、鼠抗人IgE-AP标记抗体，还包括分别包被有蟹各个分子量的蛋白和兔抗鼠IgE抗体的PVDF膜检测条，用于标本稀释、酶标抗体稀释的浓缩洗液。

所述分别包被有蟹各个分子量的蛋白和兔抗鼠IgE抗体的PVDF膜检测条的制备方法包括以下步骤：

（1）蛋白粗提液的制备如下：

取鲜活海蟹，去壳，挑取纯净肌肉组织，研磨成匀浆，按体积比1:10～1：20的比例加入-20℃的冷丙酮，置4℃冰箱脱脂，每2小时磁力搅拌30分钟，24小时后滤去丙酮，通风干燥，称量干燥后的蟹蛋白，按每克样品加入PH7.4、0.01M PBS 10～20毫升，置4℃冰箱，搅拌1-2小时，24小时后，12000转/分钟离心20分钟，收集上清，分装-20℃保存，以备用于电泳分离不同分子量的蛋白；

（2）将制备的蟹蛋白进行SDS-PAGE电泳后，利用转膜的技术将电泳后的不同条带转印至聚苯乙烯PVDF膜上，成为各个分子量的蛋白的检测区，同时，在另一PVDF膜上包被上兔抗鼠IgE抗体，作为试验的质控区，这两个PVDF膜固定于同一底衬上。

所述步骤（2）的制备方法为：

①检测区：蛋白粗提液经SDS-PAGE电泳后，PVDF膜依次经甲醇、双蒸水、转膜缓冲液浸泡，之后，干转仪15伏电压下转膜30分钟，再依次用甲醇、双蒸水、0.01MTBST冲洗，质量百分比5%的脱脂奶封闭过夜，弃去封闭液，0.01M TBST漂洗3次，每次10分钟，风干，备用；

②控制区：兔抗鼠IgE抗体调节浓度为1.6-2.4毫克/毫升，点样于PVDF膜上，室温温育2小时，依次用甲醇、蒸馏水、0.01M TBST冲洗后，5%的脱脂奶封闭过夜，弃去封闭液，0.01M TBST漂洗3次，每次10分钟，风干，备用；

③将①和②制备好的检测区和控制区固定于一个底衬上，备用。

所述用于标本稀释、酶标抗体稀释的浓缩洗液配方为：

Tris    1.21g

氯化钠  5.84g

双蒸水  80ml

调PH至8.0，加1ml质量百分比浓度30%TWEEN-20，充分搅拌后，4℃定容至100mL。