[发明专利]人胚中脑来源的神经干细胞体外定向分化为多巴胺能神经元方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种神经干细胞体外定向分化为多巴胺能神经元方法。 

背景技术

神经干细胞具有广阔的临床应用前景,细胞替代治疗可以治疗帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈病和阿耳茨海默氏病等神经退行性疾病以及脑卒中、脑外伤等引起的神经功能缺失,神经干细胞作为基因治疗的载体,可以治疗帕金森氏病、粘多糖病和颅内肿瘤等。但是,神经干细胞的研究目前尚处于初期阶段,有许多问题还没有得到解决,如神经干细胞如何在体内和体外定向分化为我们需要的某种特定的神经细胞,体外分离得到的神经干细胞与体内的是否有差异等等,这些都需要进一步的研究。 

神经干细胞的发现和研究是近十年来神经生物学领域最重要的进展之一,近年来不断有实验发现人胚脑和其它哺乳类动物一样存在具有自我更新和广泛分化潜能的神经干细胞,如何在体外通过安全有效的方法将干细胞定向诱导分化为多巴胺能神经元，并尽可能提高其分化比例，将为干细胞最终应用于临床治疗帕金斯氏病提供有力的理论支持。 

发明内容

本发明将取自胚龄10-13周水囊引产的新鲜人胚胎中分离出中脑组织，培养出神经干细胞,然后将两种安全的诱导分化方法进行组合，依次对干细胞进行多巴胺能神经元方向的分化，并用免疫组化方法予以鉴定，进行细胞计数后明确该体外诱导分化方法的效率。 

具体的方法步骤包括： 

S1：原代细胞的分离培养:取胚龄10-13周水囊引产的新鲜人胚胎，无菌条件在显微镜下分离出胚胎中脑组织，剥离脑膜及表面血管，在PBS液中漂洗三次，洗去血细胞,用细吸管轻柔吹打至组织碎块完全散开,离心洗涤后吹打制成悬液,经200目尼龙滤网过滤,制成单细胞悬液,加入含B27（1:50）（GibcoBRL）和EGF(Serotec)20ng/mL、bFGF-2(Chemicon)20ng/mL无血清培养基培养,台盼蓝染色计数活细胞,调整活细胞浓度为1×10⁵/mL,将原代细胞种植于25平方厘米培养瓶中(8mL细胞悬液/瓶),37℃,5%CO₂条件下静置培养； 

S2：神经干细胞的传代培养:原代细胞培养出现大量悬浮克隆球后进行传代培养，用0.25%胰酶37℃消化15-30min(也可机械切割分离或吹打)，制成单细胞悬液，用含B27和EGF、bFGF的无血清培养基将细胞悬液按1×10⁶/mL浓度传代接种于培养瓶，37℃,5%CO₂条件下静置培养，直至次代克隆球产生，平均5-7天传代一次； 

S3：含抗坏血酸培养液诱导分化:将不同代数的神经球体外培养七天后种植入含不同浓度抗坏血酸培养基（DMEM/F12+B27+AA）的培养皿中； 

S4：正常成人脑脊液分化培养:在以上含抗坏血酸培养液分化培养后3天，向培养基中加入正常成人脑脊液，比例为DMEM/F12+B27+30%脑脊液，观察其生长分化情况，在培养10天后进行免疫细胞化学染色； 

S5：免疫细胞化学染色:将含有分化细胞的培养板取出，4%多聚甲醛固定15min，PBS冲洗，每次5分钟，0.25%TritonX-100处理15min（破膜），PBS洗三次，每次5min，羊血清封闭15min，加入兔抗人TH抗体（一抗）37℃处理1小时，PBS冲洗三次，每次5min，后加入生物素结合的羊抗兔IgG(二抗)37℃孵育45min，PBS洗三次，每次5min，滴加SABC后室温下处理20min，PBS洗三次，每次5min，新鲜配制的DAB显色剂显色15min，PBS洗三次，每次5min，苏木精复染，光镜下观察； 

S6：细胞计数：免疫细胞化学染色TH（+）的细胞代表多巴胺能神经元，苏木精复染，蓝色细胞核数代表总细胞数。倒置显微镜下（20×）对分化的细胞随机选择六个独立视野计数TH（+）细胞，及总细胞数；每次至少做四个独立实验。残留在神经球中的神经干细胞因聚合密集，难以计数，排除在外； 

本发明的体外将神经干细胞定向分化为多巴胺能神经元的方法，先将无血清培养条件下的神经干细胞植入特定浓度的抗坏血酸培养基中诱导分化，然后加入一定浓度的正常成人脑脊液，利用脑脊液中现存的各种诱导因子进一步加速干细胞向神经元方向分化。该方法较前所报道的各种其他诱导方法明显提高多巴胺能神经元的诱导成功比例。 

附图说明

通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中：