[发明专利]绵羊毛囊特异性表达启动子片段的分离及表达模式鉴定

说明书

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及到绵羊毛囊特异性表达启动子片段的分离克隆及表达模式鉴定。

背景技术

启动子（Promoter）是基因的重要组成部分，是指一段能使基因进行转录的脱氧核糖核酸（DNA）序列。启动子通常位于基因的上游，能够被核糖核酸（RNA）聚合酶，转录调节因子等识别并与之结合形成转录起始复合物区域，从而起始基因转录。在真核生物中，根据启动子的作用方式及功能的不同可分为3种类型：组成型启动子、诱导型启动子、及组织特异型启动子。在组成型启动子的调控下，基因的表达恒定在一个水平上，具有连续性，不呈现时空特异性，亦不受外界因素的诱导；诱导型启动子需在某些特定的物理或化学信号刺激下，启动或大幅度地提高基因的转录水平；组织特异性启动子则能够调控基因在某些特定的器官或组织表达，且普遍具备发育调控特性。因为组织特异性启动子具有调控基因表达时空性的特点，所以此类启动子可以在生物工程中，用于实现外源基因表达的靶向性，减少机体能量和物质的损耗及外源基因随意表达对机体代谢活动的影响。也正因为如此，组织特异性启动子对基因工程有着重要的意义。

在真核细胞中利用基因工程技术构建多种真核表达系统进行外源基因的表达已是一项常用的技术。CMV及SV40启动子是现阶段基因工程中应用较为广泛的启动子，两者均可以携带外源基因，并在几乎所有类型的细胞中高效表达。但由于这类启动子不具备靶向调控基因表达的能力，因此往往会造成转基因个体的正常生长发育的异常而达不到实验目的。但组织特异性启动子可以很好的解决了这一难题，它可以控制外源基因在特定的组织或细胞类型中的表达，而不对其他组织的发育造成影响，因此组织特异性启动子越来越受到了科学家的青睐。但是从目前在植物及动物中获得的组织特异性启动子中分析发现，普遍存在特异性不是很高；数目较少；活性低等问题。这些极大的限制了组织特异性启动子在基因工程中的应用。

本发明以绵羊为研究材料。绵羊是我国重要的经济动物之一，是牧民赖以生存的重要经济来源，是农业生产总值的重要组成部分。毛用性状，是绵羊的主要经济性状之一，提高改善这一个经济性状，可直接提高羊的生产性能。利用基因工程技术对绵羊毛用状经济性状进行改良，是提高羊经济价值，增加牧民经济收入，提高人们生活水平的高效手段。本发明就是解决目前绵羊毛囊组织特异性启动子数目不足的问题，分离克隆并鉴定了一个绵羊毛囊特异表达启动子片段，为利用基因工程技术改良绵羊毛用状经济性状提供基础。

发明内容

本发明的目的在于克服现有可用于绵羊基因工程研究的组织特异表达启动子数目不足，从藏绵羊基因组中分离克隆并鉴定出一个具有毛囊组织表达特异性的启动子，有望将此启动子用于绵羊的基因工程改良，利用克隆得到的启动子片段构建了sKAP11.1p-GFP真核表达载体，并在启动子后插入了ZsGreen1绿荧光报告基因。将构建好的载体利用原核显微注射的方法整合到转基因小鼠基因组中，在个体水平上验证了该启动子的表达活性和组织特异性，为日后利用该启动子奠定了基础。

实现本发明任务的技术方案如下所述：

1.组织特异性表达基因验证：采集藏绵羊包括毛囊、皮肤、心、肝、脾、肺、肾、瘤胃、皱胃、小肠、大肠、淋巴（肠系膜）、脂肪、肌肉、睾丸、卵巢在内的16种组织。提取这些组织的总RNA，并用反转录PCR（RT-PCR）验证候选基因KRTAP11.1在各组织中的表达情况。结果证明KRTAP11.1只在毛囊和皮肤中有表达，通过原位杂交实验进一步验证发现，KRTAP11.1基因只在毛干中表达，是一种毛囊特异表达基因。

2.启动子克隆及载体构建：通过特异性引物，从藏绵羊基因组上扩增得到5954KB大小的启动子区域片段，命名为sKAP11.1p。并将该启动子区域连接入无启动子的pZsGreen1-1绿荧光蛋白报告载体的启动子区域中，将构建好的载体命名为sKAP11.1p-GFP。

3.启动子表达模式验证：利用显微原核注射技术制作转基因小鼠，将线性化的sKAP11.1p-GFP载体序列整合到转基因小鼠基因组中。待阳性小鼠4周龄时，采集小鼠毛发、皮肤、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、肌肉、舌、睾丸、脑组织，提取RNA。经表型观察及RT-PCR验证ZsGreen1基因只在小鼠毛发中表达，证明sKAP11.1p启动子在哺乳动物体内具有活性，且为毛囊组织特异性表达启动子。

本发明的优点在于：