[发明专利]一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养方法

权利要求书

1.一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养方法，其特征在于，该培养方法包括以下步骤：

将单个栉孔扇贝担轮幼虫细胞均匀分布在含有0.5毫升栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用高抗生素培养液的直径为35毫米细胞培养皿中，并放置到20-23℃的生化培养箱中培养，16-24小时后得贴壁的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞；

根据栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基的颜色变化，每3-7天替换栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用培养基2毫升，当栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞形成克隆时，挑取出来实现早期传代；

当传代后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。

2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用高抗生素培养液中添加有2500-25000单位/毫升青霉素、2500-25000微克/毫升链霉素。

3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基由L15基础培养基、5％胎牛血清、1％栉孔扇贝血清、2毫摩尔谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素构成。

4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤五，当传代后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养的实现方法为：

当传代后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，用移液管轻轻吹打或用细胞刮刀刮取获得解离的单个细胞，在1000转/分钟的条件下离心5分钟，再平均分散在两个细胞培养瓶中完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。

5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，体外培养的细胞取自栉孔扇贝晚期胚胎、担轮幼虫、D型幼虫的细胞，同时该培养方法也可应用在其他种类贝类生物胚胎和幼虫细胞的培养中。

6.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞时，在4℃下培养1-2天，原代培养的栉孔扇贝担轮幼虫细胞可存活且可抑制细菌污染，再转到17-25℃培养箱中，细胞也可实现稳定传代培养。

7.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，在栉孔扇贝担轮幼虫细胞培养早期，使用高浓度的青链霉素双抗液，青霉素浓度为2500单位/毫升至25000单位/毫升，链霉素浓度为2500微克/毫升至25000微克/毫升链霉素。

8.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基中添加物的最宽范围：胎牛血清添加量2％-20％，扇贝血清1％-10％，青霉素100-500单位/毫升、链霉素100-500微克/毫升。