[发明专利]多肽标志物Pep5酶联免疫检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及ELISA检测技术，具体地说，涉及一种多肽标志物Pep5酶联免疫检测试剂盒。

背景技术

结肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一，其发病率占胃肠道肿瘤的第3位。近年随着人民生活水平的提高和饮食结构的改变，其发病率呈逐年上升趋势，严重地威胁着人类健康。结肠癌常用的诊断方法有大便潜血检查、钡剂造影、结肠镜检查和血清肿瘤标志物（tumor markers，TM），前两种方法敏感性较低，结肠镜检查为侵入性检查，较多患者难以接受。TM检测在癌症筛查、诊断和治疗后随访、复发的检出和预后判断中发挥着重要作用。早期大肠癌患者预后较好，但患者常无临床症状，诊断率很低。因此，筛选和建立用于癌症早期诊断的、高敏感、高特异的血清学诊断技术，提供癌症早期预警普查，具有重大意义，市场前景可观。

目前国内外广泛采用检测血清中CEA、CA242来检测结肠癌。CEA是一种糖蛋白抗原，从结肠腺癌和胚结肠黏膜组织中分离得到，是常见的结直肠癌肿瘤标记物。由于内胚层来源的恶性肿瘤如结直肠癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等均存在CEA异常表达，且CEA释放入体循环时先经门静脉进入肝脏,而肝脏对CEA有降解作用，可影响其在外周血液中的浓度,因此CEA诊断结直肠癌不具备特异性。CA242最早是从人结直肠癌细胞Colo205单抗发现的，是一种唾液酸化的糖类抗原，与肿瘤局部宿主抗肿瘤免疫反应有关，机体免疫抑制越明显，血清CA242水平越高。研究者认为CA242更适用于胰腺癌和消化道恶性肿瘤尤其是结直肠癌的诊断。

血清中丰富的多肽资源在目前重大疾病诊断中发挥着重要作用。采用目前常规的临床手段进行多肽检测逐渐引起学术界和医药界的高度重视，基于多肽的肿瘤诊断技术正开始向临床应用高速发展，肿瘤的早期预警技术也在开发之中，一些多肽的联合应用有可能为肿瘤等重大疾病的预警提供革新性的突破。

发明内容

本发明的目的是提供一种多肽标志物Pep5酶联免疫检测试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明的一种多肽标志物Pep5酶联免疫检测试剂盒，所述检测试剂盒含有经酶（优选辣根过氧化物酶）标记的由保藏号为CGMCC No.5269的单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

优选地，所述检测试剂盒还含有包被液、封闭液、清洗液、显色液、2M硫酸、终止液和固相反应板中的一种或多种。更优选所述显色液为TMB显色液。

其中，以多肽标志物Pep5抗原（序列Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln的多肽，命名为Pep5）与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)的偶联物免疫原，免疫BALB/C小鼠，然后筛选出的杂交瘤细胞株。本发明提供的抗多肽标志物Pep5的单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105（即，抗人原发性肝癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105）现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2011年9月27日，保藏号为CGMCC No.5269。

本发明还提供利用上述检测试剂盒定量检测肠腺癌血清中多肽标志物Pep5方法，包括如下步骤：将待测血清与包被液包被过夜，清洗若干次，采用封闭液进行封闭，清洗若干次，加入酶标记的多肽抗体，清洗若干次，显色液显色，加入终止液进行终止，检测OD_450nm值。

其中，HRP标记的单克隆抗体与血清样品中的多肽标志物Pep5抗原发生特异性结合，并用显色液显色。

具体步骤如下：

1）包被：取5-30μL待测血清，加入70μL-95μL包被液，置于96孔板中，4℃放置过夜或37℃放置2小时；同时加入100μL包被液作为阴性对照；

2）清洗：弃包被液，用0.01M、pH7.4PBST缓冲液200-300μL清洗5-7次，拍干；

3）封闭：加入200-300μL 5%的脱脂奶粉，37℃静置封闭2小时；

4）清洗：弃封闭液，用0.01M、pH7.4PBST缓冲液200-300μL清洗5-7次，拍干；

5）酶结合物：加入80-120μL HRP标记抗体，37℃静置1小时；

6）清洗：弃抗体溶液，用0.01M、pH7.4PBST缓冲液200-300μL清洗5-7次，拍干；

7）显色：加入80-120μL显色液，37℃避光孵育15min显色；8）终止：加入30-70μL 2M硫酸，终止反应；