[发明专利]与肝病进程相关的检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及定量检测与肝病进程相关的酶联免疫吸附法检测试剂盒及其应用。

背景技术

肝硬化是一种常见的慢性肝病，是由一种或多种病因长期或反复作用引起的肝脏弥漫性损害。肝纤维化是多种慢性肝病共有的组织学改变。肝纤维化是肝脏对慢性损伤的一种修复反应，是慢性肝病共有的病理改变，不仅是向肝硬化发展的必由之路，而且贯穿于肝硬化的全过程。

目前“肝炎—肝纤维化—肝硬化—肝癌”，这一链条已被认为是各种慢性肝病导致严重后果的共同途径。临床研究发现，肝纤维化的诊断方法主要包括影像学、病理学和血清学诊断3种。影像学诊断主要是B超和CT，在临床应用广泛，但只能在肝纤维化晚期，发生肝硬化和门脉高压症时才能出现异常图像，不能做出早期诊断。肝纤维化的诊断金标准虽是肝组织活检，但其本身也存在许多问题，如肝穿刺的盲目性、取材不够、肝脏病变的不均一性而导致取样误差；虽属于微创检查，但多数患者不愿接受，且不能反复取材进行动态观察。

肝纤维化是发展至肝硬化的必经阶段；临床数据表明，有80%的肝癌患者是由肝硬化进一步恶化所至。因此，在肝纤维化阶段进行早期发现治疗，尚有好转的可能。由此可以看出肝纤维化的临床诊断和治疗对于慢性肝病极为重要。

因此迫切需要一种特异性强、结果可靠、操作性强、简单可行的对肝纤维化进行检测，对肝病进程的发展进行有效监测的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供保藏号为CGMCC No.5269的单克隆抗体杂交瘤细胞株在制备肝病进程相关的检测试剂或试剂盒中的应用。

本发明中，特异性定量检测多肽标志物Pep5的单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105，是以多肽标志物抗原（序列为Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln的多肽，命名为多肽5，简称Pep5）与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)的偶联物免疫原，免疫BALB/C小鼠，然后筛选出的杂交瘤细胞株。本发明提供的特异性定量检测肝病进程相关的多肽标志物Pep5的单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105，已于2011年9月27号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101）保藏，保藏号为CGMCC No.5269。

本发明中，所述的检测试剂盒优选为酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒。

其中，所述的ELISA试剂盒含有辣根过氧化物酶标记的本发明所述的单克隆抗体。

其中，所述的ELISA试剂盒还含有包被液、封闭液、显色液、终止液和固相反应板。

其中，所述的ELISA试剂盒进一步含有对多肽标志物进行定量检测用的校准品、质控品。

进一步，所述包被液优选为碳酸盐缓冲液、封闭液优选为5%脱脂奶粉、显色液优选为TMB显色液、终止液优选为2M硫酸、固相反应板优选96孔聚丙乙烯微孔板。

所述校准品、质控品为系列稀释度的Pep5稀释液。

本发明的ELISA试剂盒在制备肝病进程相关的检测试剂或试剂盒中的应用，具体包括以下步骤：

1）包被：取5-30μL临床血清，加入70μL-95μL包被液，置于96孔板中，4℃放置过夜或37℃放置2小时；同时加入100μL包被液作为阴性对照；

2）清洗：弃包被液，用0.01M、pH7.4 PBST缓冲液200-300μL清洗5-7次，拍干；

3）封闭：加入200-300μL 5%的脱脂奶粉，37℃静置封闭2小时；

4）清洗：弃封闭液，用0.01M、pH7.4 PBST缓冲液200-300μL清洗5-7次，拍干；

5）酶结合物：加入80-120μL HRP标记抗体，37℃静置1小时；

6）清洗：弃抗体溶液，用0.01M、pH7.4 PBST缓冲液200-300μL清洗5-7次，拍干；

7）显色：加入80-120μL显色液，37℃避光孵育15min显色；

8）终止：加入30-70μL 2M硫酸，终止反应；

9）读数：用酶联检测仪测定波长450nm的光吸收值；

10）判别：以检测OD值与阴性OD值之比大于2.1为阳性。

本发明中，术语“肝病进程”包括肝炎—肝纤维化—肝硬化—肝癌，肝纤维化是向肝硬化发展的必由之路。

针对上述技术方案，本发明具有以下优点和效果：