[发明专利]一组特异识别伏马菌素B1的寡核苷酸适配子

说明书

技术领域

本发明涉及一组特异识别伏马菌素B1的寡核苷酸适配子及其制备方法，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)制备一组特异结合伏马菌素B1的寡核苷酸适配子，属于生物技术领域。

背景技术

伏马菌素(Fumonisins)是串珠镰刀菌在一定湿度和温度条件下繁殖所产生的水溶性次级代谢产物，在全世界范围内分布广泛，主要污染粮食作物及饲料尤其对玉米及其制品污染严重，还可存在于以谷物为原料的一些产品中，如面条、啤酒、调味品等。伏马菌素的热稳定性高，不易被破坏，对人畜具有神经毒性、肺毒性等多种毒性及致癌性，主要损伤肝脏和肾脏，严重危害人类和动物的健康。国际癌症研究院(The International Agency for Research onCancer)已将伏马菌素定为2B组致癌物质(可能是人类致癌物)，其中伏马菌素B1的毒性强且污染率高。加入WTO之后，农产品及相关食品的国际贸易量日益增加，随之对进出口产品生物安全性的要求也越来越高。为了保证这类产品的顺利进出口贸易和食用者的健康，出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等部门迫切需要一种特异、快速、简便的伏马菌素B1检测方法。

目前伏马菌素B1的测定方法有多种，如：薄层层析法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC/MS)、毛细管电泳法(CE)、液相色谱-质谱法(LC/MS)和酶联免疫测定法(ELISA)等方法。薄层层析法操作简单，适合于没有经过专门培训的人员操作，且成本低，无需价格昂贵的仪器；但其步骤较繁琐，灵敏度低。HPLC法准确度高，灵敏度性强，可作为定量检测方法，但是这种方法前处理过程繁琐，操作复杂，在实验时需要对伏马菌素进行柱前衍生化处理，而且通常需要专业人员进行操作，仪器设备昂贵，检测过程耗时且费用较高，不适于在基层推广及大量样品的现场快速检测。ELISA法特异性强，灵敏度高，准确性好，操作简便，适于大批量样品的检测；但检测的灵敏度和试剂盒的稳定性方面离实际应用还有一定的距离，此外免疫法需依赖于制备繁琐耗时且成本昂贵的抗体，且制得的抗体批次间稳定性不如寡核苷酸，抗体的储存条件也较寡核苷酸严苛。

近些年来，寡核苷酸适配子作为抗体分子的前景性替代分子，其研究较为引人注目。寡核苷酸适配子是通过SELEX过程筛选的与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA或RNA片段。SELEX技术(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment，系统进化指数富集技术)是20世纪90年代发展起来的一种新的组合化学技术，具有经济、简便、快速、适用范围广等特点。SELEX技术利用大容量的随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸，并结合PCR体外扩增技术，使其得到指数级富集，经过多轮筛选最终获得高亲和力、高特异性的寡核苷酸适配子。与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸随机文库中筛选出的适配子具有很多优势：(1)寡核苷酸分子本身分子量很小，其化学结构和性质提供了易于标记的特性，易于合成及化学修饰使之便于后续试验；(2)不依赖于动物体内免疫，不存在抗体由于不同批次生产带来的差异性；(3)某些寡核苷酸适配子具有强于抗体的亲和性和特异性，无免疫原性；(4)核苷酸稳定性好，易于保存和运输，对高温和剧烈环境不如抗体敏感。

本发明以食品及环境中常见的伏马菌素B1为靶标，利用竞争SELEX技术制备获得了与伏马菌素B1高特异性高亲和力结合的寡核苷酸适配子。该寡核苷酸适配子经修饰后可直接用于荧光或化学发光、发色方法检测伏马菌素B1以丰富实验室检测手段，也可用于开发伏马菌素B1试纸条或便携式小型仪器以实现家庭、农田、工厂快速检测，因此该发明可以在食品安全检测、环境监测等领域得到广泛应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能与伏马菌素B1特异性结合的寡核苷酸适配子并用于快速、准确检测伏马菌素B1，为开发新型伏马菌素B1分析方法或检测工具奠定良好基础。

本发明采用以下技术方案：