[发明专利]一种兔抗牛αs -酪蛋白多克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种兔抗牛α_s-酪蛋白多克隆抗体的制备方法。 

背景技术

近年来，人们对乳品质的要求越来越高，乳蛋白作为衡量乳品质的重要指标，其合成的营养调控已成为奶牛营养学研究的热点。乳蛋白大部分是由奶牛乳腺上皮细胞从头合成和分泌的，80%的乳蛋白由酪蛋白组成，而牛乳中的酪蛋白主要由α_s-酪蛋白（α_s-casein）组成（约45%-55%），因此研究调控α_s-酪蛋白的合成具有重要意义。检测牛乳或乳腺细胞合成分泌的酪蛋白最常用的方法主要包括ELISA法和Western-blot法，而这两种方法均需用到酪蛋白抗体，目前没有商品化的奶牛α_s-酪蛋白抗体，因此本发明通过免疫新西兰兔来制备兔抗牛α_s-酪蛋白多克隆抗体，旨在为研究奶牛α_s-酪蛋白合成的调控提供有效的试验材料。为得到纯度较高、特异性较强的抗体，本发明通过饱和硫酸铵和蛋白A树脂对抗血清进行两次纯化，纯化后得到的抗体用Western-blot法鉴定其与α_s-酪蛋白纯品及乳腺组织中α_s-酪蛋白的有无特异性反应。 

发明内容

本发明的目的是建立一种兔抗牛α_s-酪蛋白多克隆抗体的制备方法，为鉴定奶牛乳腺组织合成的α_s-酪蛋白提供试验材料。 

为实现上述目的，具体的实施方案为： 

选用健康新西兰大白兔每两周免疫一次奶牛α_s-酪蛋白，待血清达到抗体效价后，对兔进行颈动脉放血并分离血清，利用饱和硫酸铵法和蛋白A树脂纯化抗体。分别用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western-blot）法鉴定纯化后抗体的纯度和特异性，最后用Western-blot法鉴定该抗体其与奶牛乳腺组织合成的α_s-酪蛋白的反应性。 

本发明步骤如下： 

步骤（1）.免疫动物：用α_s-酪蛋白纯品对免疫动物（新西兰大白兔）实施每两周一次的免疫程序，初免使用弗氏完全佐剂，以后使用弗氏不完全佐剂。 

步骤（2）.取动脉血：取免疫动物动脉血，离心分离血清，超低温冰箱保存备用。 

步骤（3）.抗体纯化：用饱和硫酸铵法对血清进行初步纯化，然后用蛋白A树脂进一步纯化得抗体。 

抗体纯度鉴定：SDS-PAGE分离纯化后的抗体，凝胶成像系统拍照观察其条带，据此判断纯化后抗体的纯度。 

抗体效价测定：ELISA测定抗体效价，酶标板用α_s-酪蛋白纯品包被，取不同稀释度的纯化后的抗体进行孵育，二抗孵育后，加入底物溶液和终止液在酶标仪上测定并读取吸光值。 

抗体特异性鉴定：Western-blot法鉴定纯化后的抗体与α_s-酪蛋白及乳腺组织合成的α_s-酪蛋白的反应性，SAS-PADE电泳结束后进行切胶，转膜，封闭，一抗、二抗孵育，DAB显色剂显色，扫描观察结果。 

尽管蛋白A树脂纯化多克隆抗体得到的免疫球蛋白纯度较高，但这种树脂价格昂贵，而且多次反复使用后与免疫球蛋白的结合活性降低，因此，为了提高蛋白A树脂的使用寿命和节约成本，本发明先用饱和硫酸铵对抗体进行粗提纯后再用蛋白A树脂进行亲和层析纯化，最终得到了纯度较高的抗体，而且能够特异性与α_s-酪蛋白发生抗原抗体结合反应，并成功用于鉴定奶牛乳腺组织中α_s-酪蛋白的合成。

附图说明 

图1是SDS-PAGE结果。 

图2是Western-blot结果。 

图3是抗体在检测奶牛乳腺组织α_s-酪蛋白合成上的应用。 

具体实施方式

1材料与方法 

1.1试验材料