[发明专利]基于表面等离子体耦合效应的均相多组分免疫分析方法

说明书

技术领域

本发明属于一种基于表面等离子体耦合效应的均相多组分免疫分析方法，具体是指纳米材料的生物功能化和应用，表面增强拉曼共振(SERS)以及耦合增强效应，蛋白质定量和免疫分析技术。

背景技术

蛋白质分子标志物的定量检测对于蛋白组学研究具有重要的意义，它作为一种分析指标，可以灵敏的反应治疗药物在疾病模型中的药效。目前的免疫分析技术都是利用了抗原抗体免疫夹心反应原理，传统的检测方法多以固相反应为主，先固定捕获抗体，再依次结合抗原和检测抗体，洗脱步骤多，费时费力。另外，还建立了一些新的免疫分析技术，如磁分离分析技术，微流控免疫分析技术，基于场效应晶体管的纳米管技术等，这些分析方法灵敏、快速、特异，但是，需要借助于复杂的仪器，操作难度高，实验人员需要掌握一定的技术。

发明内容

本发明针对现有技术存在的不足，提出了一种基于表面等离子体耦合效应的均相多组分免疫分析方法，检测过程只需要一步操作，简单、快速，不需要洗脱，无需对样品进行分离，实现了样品中含有多个组分的同步定量分析，灵敏度高，特异性好。

当贵金属纳米颗粒表面等离子体受到激发，在颗粒表面产生电磁场，显著增强了表面吸附分子的拉曼信号；当纳米颗粒之间的距离足够接近时，表面等离子体产生耦合作用，形成了更强的电磁场，对表面吸附分子的拉曼信号能达到10⁴~10¹⁵倍的增强作用。

本发明所述的基于表面等离子体耦合效应的均相多组分免疫分析方法，包括制备表面修饰有拉曼活性染料和抗体的纳米颗粒探针，抗原抗体结合拉近纳米颗粒之间的距离，表面等离子体产生耦合，利用耦合增强效应进行SERS定量分析。其中，所述的纳米颗粒表面功能化修饰是通过Au-S键共价作用来实现的，拉曼活性染料自身带有巯基且无荧光背景，抗体经三（2-羧乙基）膦盐酸盐(TCEP)还原处理。

本发明所述的免疫分析方法，分别制备了表面修饰有拉曼活性染料和捕获抗体的金纳米球探针和表面修饰有拉曼活性染料和检测抗体的金纳米棒探针，待测物抗原与抗体发生免疫夹心反应，生成免疫复合物，拉近纳米颗粒之间的距离，产生表面等离子体耦合效应，显著增强了纳米颗粒表面修饰染料的拉曼信号，利用这种耦合增强效应实现了对抗原的SERS定量分析。

本发明所述的多组分免疫分析方法包括如下步骤：

（1）制备修饰有拉曼活性染料和检测抗体（多抗）的金纳米棒探针；

（2）制备修饰有拉曼活性染料和捕获抗体（单抗）的金纳米球探针；

（3）将待测物样品加入到含有步骤（1）和（2）所述的两种金纳米颗粒探针的缓冲溶液中，发生免疫夹心反应；

（4）对反应后的样品溶液进行检测。

其中，针对不同的待测物抗原，步骤（1）所述的金纳米棒探针是表面修饰有不同的拉曼活性染料和不同的检测抗体的纳米颗粒探针。

其中，针对不同的待测物抗原，步骤（2）所述的金纳米球探针是表面修饰有不同的拉曼活性染料和不同的捕获抗体的纳米颗粒探针。

其中，针对一种待测物抗原，步骤（1）所述的金纳米棒探针和步骤（2）所述的金纳米球探针是表面修饰有同一种拉曼活性染料的纳米颗粒探针。

其中，步骤（4）所述的检测手段是利用拉曼光谱仪对产物溶液进行定量分析。

其中，所述的检测抗体和捕获抗体均经过三（2-羧乙基）膦盐酸盐(TCEP)还原处理。

以下结合具体的操作步骤对本发明做进一步的说明（以样品中含有三种待测抗原为例）：

（1）分别制备了三种能与待测抗原（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ）特异性结合的金纳米棒探针Ⅰ，金纳米棒探针Ⅱ，金纳米棒探针Ⅲ。金纳米棒探针Ⅰ是表面修饰有拉曼染料(1), 检测抗体(1)和BSA的纳米颗粒探针，金纳米棒探针Ⅱ是表面修饰有拉曼染料(2), 检测抗体(2)和BSA的纳米颗粒探针，金纳米棒探针Ⅲ是表面修饰有拉曼染料(3), 检测抗体(3)和BSA的纳米颗粒探针。

（2）分别制备了三种能与待测抗原（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ）特异性结合的金纳米球探针Ⅰ，金纳米球探针Ⅱ，金纳米球探针Ⅲ。金纳米球探针Ⅰ是表面修饰有拉曼染料(1), 捕获抗体(1)和BSA的纳米颗粒探针，金纳米球探针Ⅱ是表面修饰有拉曼染料(2), 捕获抗体(2)和BSA的纳米颗粒探针，金纳米球探针Ⅲ是表面修饰有拉曼染料(3), 捕获抗体(3)和BSA的纳米颗粒探针。

（3）将步骤（1）和（2）所述的两种金纳米颗粒探针加入到含有三种待测抗原的样品溶液中，抗原与抗体发生免疫夹心反应。