[发明专利]一种小鼠肝星状细胞的改良分离方法

权利要求书

1.一种小鼠肝星状细胞的改良分离方法，其方法如下：

第一步：选取雄性BALB/c小鼠，体质量25～30g，普通饲料喂养，自由进食进饮，对其操作前禁食12h；

第二步：将选取的小鼠用3％戊巴比妥钠腹腔注射，待麻醉起效后，固定于工作台中，用75％乙醇腹部洗浴消毒，剔毛、75％乙醇再次消毒、剖腹，将肠管推于左侧，充分暴露门静脉、下腔静脉、上腔静脉，在下腔静脉、上腔静脉各预置1号缝线1根，暂不结扎，楔形剪开下腔静脉，插管，结扎固定，同时结扎上腔静脉，剪开门静脉；

第三步：采用37℃预热的D-HanK’s液对门静脉进行灌注，速度为5～7mL/min，灌注7min后，观察肝脏变黄白，流出的D-HanK’s液中无肉眼可见血液后，开始灌注37℃预热含胶原蛋白酶的HBSS溶液，10min左右，速度为3～5mL/min，直至肝脏变软、变脆，压之凹陷不易恢复时，结束灌注；

第四步：取肝脏置于消毒平皿内，去除肝包膜、血管等纤维结缔组织，去除胆囊，充分细致剪碎肝组织，加入HBSS液20mL，于37℃进行震荡消化25min得到细胞悬液；

第五步：细胞悬液中加入4℃含20％FBS的DMEM液20mL终止消化，经200目滤网过滤进入50mL聚丙烯离心管中，30Xg离心5min，取上清液，上清液450Xg离心7min，去上清，取沉淀，加入6mL的15％的optiprep，充分混匀，在混合液上面加6mL的11.5％的optiprep，然后在其上再加6mL的HBSS，1400Xg，4℃离心18min后，吸取界面层细胞。