[发明专利]家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质纯化技术领域，具体涉及一种家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法。

背景技术

蚕蛹蛋白是一种优质的蛋白质资源，含有18种氨基酸，其中8种人体必需氨基酸含量超过氨基酸总量的40%，其蛋白极易水解被人体消化吸收，是一种比较理想的蛋白来源。研究表明，蚕蛹蛋白质与氨基酸具有特殊的生理活性，其多肽具有降低血清胆固醇和抗氧化作用。据报道，蚕蛹复合氨基酸具有明显促进幼年雄性大鼠体重增长和血液运输氧气和营养物质能力、促进机体蛋白质合成，加速新陈代谢、提高机体免疫能力和肾上腺机能等多种生理活性，可为生化制药及食用蛋白提供廉价的原料。

家蚕蚕蛹中存在70%左右的30kD蛋白群，这一蛋白群具有载脂蛋白功能，参与抑制家蚕的细胞程序性死亡，并且可以抑制人类细胞的程序性死亡。

目前对于30kD蛋白群的纯化方法都较为繁琐，而且纯化效率也不是很高。中国专利申请（公开号102424701）公开了一种蚕蛹中人生长激素类似脂蛋白的纯化方法，需要经过匀浆、离心、硫酸铵沉淀、蛋白纯化仪纯化、亲和层析纯化、超滤浓缩等必需步骤。

发明内容

为了解决现有技术中30kD蛋白群纯化步骤复杂繁琐，成本较高，纯化效率低的缺陷，本发明提供了一种新的家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法，主要依据蛋白分子量大小，通过简单的硫酸铵分级沉淀，离心和超滤膜包超滤方法，获得的30kD蛋白群。

本发明提供的家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法，纯化步骤为：取家蚕蚕蛹进行破碎细胞，细胞破碎液离心后取上清进行硫酸铵分级沉淀，沉淀重悬后经过80kD~100kD超滤膜超滤，流出液再经过30kD~50kD超滤膜超滤，收集截留液，最终获得30kD蛋白群。

家蚕蚕蛹可以使用新鲜蚕蛹、经过干燥或冷冻干燥等处理的蚕蛹产品。

优选地，纯化在0~4℃的温度条件下进行。30kD蛋白群为具有生物活性的蛋白群，提纯过程中最好能够保持在低温条件下进行以避免被降解，确保最终提纯的蛋白质仍然具有生物活性且保持较高的纯度。

优选地，所述破碎细胞使用匀浆的方法，用的PBS与家蚕蚕蛹混合匀浆。PBS为磷酸盐缓冲液，配方如下：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄，pH7.4~7.6。优选使用预冷的PBS，预冷是指在实验前先进行降温，例如放在4℃冰箱降温。

PBS体积优选为蚕蛹体积的十倍，可以充分溶解蚕蛹中的蛋白。细胞破碎方法较多使用超声波破碎法、捣碎机破碎法、反复冻融法和化学法等，就本发明的30kD蛋白群来说，使用匀浆法既能满足破碎充分且不致蛋白失活的要求，也能最大程度地节约成本，该方法通过简单的实验装置和操作就能大量获得含有目的蛋白的优化原料，且价格便宜有利于大规模纯化工艺的建立。

优选地，所述离心的速率为8000rpm以上。更优选为8000~12000rpm。30kD蛋白群为分子量较小的蛋白群，如果转速过低，则无法分离出这一蛋白群。

优选地，所述硫酸铵分级沉淀的步骤之前还包括将细胞破碎液离心后的上清用9层纱布过滤的步骤。该步骤主要用于除去上清液中的不溶物质和油脂等成分，便于后续纯化的顺利进行，该步骤也可以在后续的步骤中按需要添加。

优选地，所述硫酸铵分级沉淀是用饱和度为25%的(NH₄)₂SO₄盐溶，用饱和度为65%的(NH₄)₂SO₄盐析。在分段盐析时，加盐浓度一般以饱和度表示，饱和溶液的饱和度定为100%。硫酸铵的盐溶和盐析浓度为最适宜30kD蛋白群的浓度，最大限度地提高了30kD蛋白群的纯化率。且对硫酸铵溶液的pH值无任何限制，便于溶液配制，简化了提纯步骤。

优选地，沉淀重悬后经过100kD超滤膜超滤，流出液再经过30kD超滤膜超滤。经过多次试验发现，使用100kD和30kD超滤膜，能够提高30kD蛋白群的纯化率。

优选地，所述收集截留液是使用截留液体积3~10倍的PBS反复冲洗超滤系统，收集洗出液。这样能够获得最大量的目的蛋白。PBS体积最佳为截留液体积的10倍。

本发明具有以下有益效果：