[发明专利]一种人胰岛来源的胰腺干细胞系的构建及向胰岛素分泌细胞分化的方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，特别涉及一种人胰岛来源的胰腺干细胞系构建及向胰岛素分泌细胞分化的方法。 

背景技术

糖尿病是继心血管疾病和癌症之后的第三大高发慢性疾病，它严重危害着人类的生命健康。目前，对糖尿病的治疗虽然有很多方法，如口服降糖药物，注射外源性胰岛素，并结合饮食限制以及体育锻炼的方法，但都不能从根本上解决问题。器官移植是一种比较好的解决方法，但该方法的应用受到供体不足和免疫排斥问题的限制。而干细胞增殖力强、数量充足、移植排斥反应相对较低。因此，人们寄希望于干细胞替代疗法能够解决供体不足和免疫排斥的问题。 

干细胞的使用虽然能够解决供体细胞数量问题，但是在应用前还需要先将其诱导分化为功能性的胰岛素分泌细胞。胰腺干细胞(Pancreatic stem cells)是一类存在于胎儿和成年胰腺组织中的成体干细胞，具有自我更新，多向分化潜能，在自然分化过程中首先分化为胰腺组织内的各种细胞。由于该细胞来源于胰腺组织，因此，在向胰岛素分泌细胞分化方面具有更大的潜力。越来越多的证据表明胰腺导管、胰岛和腺泡组织内都存在着具有多向分化潜能的干细胞。目前有观点认为，由胰岛组织获得的间充质样干细胞可能来源于去分化后的β细胞(Russ，H.A.，Bar，Y.，Ravassard，P.，Efrat，S.2008 In vitroproliferation of cells derived from adult human beta-cells revealed bycell-lineage tracing.Diabetes，57：1575～1583)。并且这些细胞在体外多次传代后其胰岛素启动子仍处于活化状态，因此具有巨大的糖尿病治疗潜力。 

体外分离、培养胰腺干细胞作为种子细胞，并将其定向诱导分化为功能性胰岛细胞，是解决胰岛供体短缺的有效途径。已有多个研究小组在胰腺干细胞的研究上开展了一定的基础工作。西北农林科技大学效梅(单克隆人胰腺干细胞分离培养体系的建立[J].分子细胞生物学，2008，41(6)：450-456.)、赵婷(人胰腺干细胞诱导胰岛样细胞团及其治疗大鼠糖尿病的效果[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11(7)：1259-1262.)、第三军医大学姚忠祥(人胰腺干细胞的体外分离培养、鉴定和分化特性[J].第三军医大学学报，2003，25(1)：23-25.)吉林大学等先后在胰腺干细胞的分离纯化，培养基的筛选，以及细胞生物学，分子生物学鉴定方面做了大量的工作；分离到的胰腺干细胞在体内定向诱导后形成胰岛样细胞团，并检测到胰岛素和C-肽的分泌，但分化效率都很低，移植后对糖尿病的治疗效果不显著。 

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种人胰岛来源的胰腺干细胞系体外构建的方法，将该干细胞系体外诱导分化成胰岛样细胞团的方法，以及用上述方法得到的胰腺干细胞系和胰岛样细胞团。将所述胰岛样细胞团移植至糖尿病模型动物后能够改善其血糖水平。 

本发明提供一种人胰岛来源的胰腺干细胞系体外构建的方法，该方法包括如下步骤：消化人胰腺组织，挑出胰岛细胞团，进一步消化形成单细胞悬液，传代培养后形成间充质样胰腺干细胞。 

所述的胰腺干细胞系，其细胞为成纤维样，多呈三角形和短梭状，单核细胞，有两个或两个以上的核仁，细胞间存在接触抑制。 

所述的胰腺干细胞系，经诱导可分化形成胰岛样细胞团。 

本发明的第一方面提供一种人胰岛来源的胰腺干细胞系的构建方法，包括以下步骤： 

1)将人胰腺细胞加入培养液A中培养2-3天； 

2)挑出上述培养物中的胰岛细胞团，用蛋白酶消化成单细胞，接种于培养液A中培养； 

3)待细胞生长至80-90％融合时，传代，加入培养液B培养，得 到胰岛细胞来源的人胰腺干细胞系(hPSC)； 

其中所述培养液A为含有10-25％ FBS、8-12mM尼克酰胺、18-22ng/mL EGF和18-22ng/mL bFGF的RPMI1640；所述培养液B为含有10-25％FBS、18-22ng/mLbFGF的Low-DMEM。 

在一个实施方案中，所述培养液A还含有0.8-1.2mM丙酮酸钠、1.8-2.2mM谷氨酰氨、0.05-0.15mM β-巯基乙醇和90-110mg/mL青霉素/链霉素；所述培养液B还含有0.05-0.15mM β-巯基乙醇、1.8-2.2mM谷氨酰胺和90-110mg/mL青霉素/链霉素。 

在一个优选实施方案中，上述方法包括以下步骤：