[发明专利]凝集素用于识别、纯化干细胞的方法、试剂盒及应用方法

权利要求书

1.凝集素用于识别、纯化干细胞的方法，其特征在于，其包括：

(1)在使所述细胞群与细胞预处理试剂预先接触条件下，使样品接触一种凝集素，后者含有：(a)至少一种凝集素，其可识别糖蛋白和/或糖脂糖链末端特异位点，该凝集素与(b)至少一种结合物进行直接或间接连接；和

(2)将与所述凝集素结合物结合的细胞群从所述样品中分离，获得富含干细胞的样品，其中，所述细胞上存在与所述凝集素特异亲和性的受体表明它们是干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，可通过加入洗脱糖的方法把凝集素结合物从所述细胞群上洗脱，从而获得不含任何外来标记的富含干细胞的样品。

3.细胞预处理过程选择采用沉淀或裂解法沉淀或裂解细胞群中的红细胞的试剂，所述试剂可选择为质量浓度为0.1～20％的羟乙基淀粉、明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基淀粉的任一一种；或可选择为氯化铵红细胞裂解液、质量浓度小于0.9％的生理盐水溶液的任一一种；或可选择泛影酸钠-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一种进行细胞预处理，其中，所述试剂至少重复接触所述细胞群一次。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝集素结合物中的凝集素包括天然的或化学合成的植物凝集素、动物凝集素或其衍生物的一种或两种以上的组合，所述凝集素的浓度为0.001～40mg/ml，与所述细胞群接触的时间为小于或等于120分钟，孵育温度为小于或等于38℃。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述凝集素结合物中的结合物可选择预先与荧光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一种进行结合，或选择具有对凝集素有亲和力抗体或抗体衍生物或抗体片段的一种。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述与凝集素结合的高分子量的生物大分子的分子量在一万道尔顿(Mw)至八十万道尔顿(Mw)之间，其中所述高分子量的生物大分子可选择为牛血清白蛋白、羟乙基淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一种。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含干细胞的细胞群来源于啮齿动物、人类或其他哺乳动物的成体组织、肿瘤/癌前组织、肿瘤/癌性组织、转移瘤/癌组织或其他潜在包含干细胞的一种或两种以上组织的组合，或选择来自所述组织的原代、传代细胞群的一种或两种以上的组合。

8.凝集素用于识别、纯化干细胞的试剂盒及其应用方法，其中，所述凝集素还可用于确定组织、细胞群中干细胞存在与含量，其在用于从所述细胞群中富集、提纯干细胞的用途。

9.根据权利要求8所述的用于识别、纯化干细胞的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：

1)细胞预处理试剂A；

2)识别、纯化试剂B；

3)以及任选的容器；

其中，所述细胞预处理试剂A可选择为质量浓度为01～20％的羟乙基淀粉、明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基淀粉的任一一种；或可选择为氯化铵红细胞裂解液、质量浓度小于0.9％的生理盐水溶液的任一一种；细胞预处理试剂或可选择为泛影酸钠-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一种，其中，所述试剂至少重复接触所述细胞群一次。

其中，识别、纯化试剂B为凝集素结合物，包括但不限于天然的或人工合成的植物凝集素、动物凝集素或其衍生物的一种或两种以上的组合，其中所述凝集素结合物中的结合物可选择预先与荧光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一种进行结合，或选择具有对凝集素有亲和力抗体或抗体衍生物或抗体片段的一种，所述凝集素的浓度为0.001～40mg/ml，与所述细胞群接触的时间为小于或等于120分钟，孵育温度为小于或等于38℃。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述含干细胞的细胞群是啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的正常成体和或病变、肿瘤、癌前、癌性、癌转移组织，或来自所述组织的原代、传代细胞群的一种或两种以上的组合。

11.根据权利要求1或9中任一权利要求所述，其中，随后可选择采用荧光活化细胞分选法用于鉴定和分选结合凝集素结合化合物的细胞群或选择沉淀法分离结合凝集素的所述细胞群，进一步，分离的所述干细胞，其包含细胞膜上的可与凝集素结合的受体。