[发明专利]用于富集、提纯干细胞的方法、试剂盒及其应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及富集、提纯干细胞的方法、试剂盒及其应用方法，具体而言，涉及从啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的细胞群中富集提纯干细胞的方法、试剂盒，所提纯的干细胞在诸如诊断、药物筛选、基础研究、组织工程、修复受损及病变组织中的应用。

背景技术

众所周知，干细胞具有下述特征：1)长期的自我更新能力；2)能够产生高度分化的其它种类细胞；3)本身处于未分化状态；4)一般处于慢周期或静息状态；5)组织中处于相应的小生境(niches)内。

基于它们的潜能，干细胞可被细分和分类为下面三个类型：第一种是，可生长为任意类型的全能性干细胞，他们由卵细胞和精细胞融合产生；第二种是，可以分化为除全能性干细胞以外所有类型的细胞，它们被称为多能性干细胞；而第三种是仅可以产生一种细胞类型的细胞，这些细胞被称为专能干细胞或祖细胞，它们仍具有自我更新的特性，这个特性使得他们可与非干细胞区分开(Krause DS等，Cell，2001.105：369-377；Reya T等，Nature，2001.414：105-111)。

根据它们的来源，干细胞被分为胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)和成体干细胞(Adult StemCells，ASCs)，胚胎干细胞是全能性的，在理论上于体内可以再生身体内几乎任意组织，然而，其目前主要的难题在于如何能够获得高纯度的胚胎干细胞群。当其应用于细胞治疗时，残留的未分化的胚胎干细胞具有潜在的致瘤性，因此未分化的胚胎干细胞必须在治疗前移除。另外，不纯的胚胎干细胞将会导致药物筛选在有效性、毒理学、分化潜能或其它方面的评价方面有偏差，因此需要开发一种可靠的方法用于识别和纯化胚胎干细胞。随着研究的进展，研究者发现了可用于识别干细胞的抗体(Andrews PW等，Hybridoma.1984；3：347-361；Kannagi R等，EMBO J 1983；2：2355-2361；Kannagi R等，J Biol Chem.1983；258：8934-8942；Kolle G等，Stem Cells.2009；27：2446-2456)，但目前获得典型的胚胎干细胞特异性表面分子标志仍是极具挑战性的任务。这阻碍了胚胎干细胞的广泛应用。

成体干细胞是另外一类具有修复、再生、替代能力的未分化细胞类型，通常位于特定的小生境内，在受到外界损伤后，其会动员或者产生新的干细胞，通过增殖、分化的方式形成新的功能细胞，从而调节组织和器官细胞数量保持动态平衡。成体干细胞的多能性特点首先在骨髓中得到的成体干细胞得以发现。造血干细胞是目前研究的最为详尽的成体干细胞之一，在过去近40年里一直是干细胞领域研究的主题，它们在体内进行自我更新的细胞分裂，在单细胞水平分化为所有的造血成份，并在机能上使得重度骨髓抑制的动物和人的骨髓得以恢复。

成体干细胞研究的基础和其在临床上的应用先决条件和最关键条件之一是对干/祖细胞的有效识别、筛选分离。最近越来越多的证据表明成体干细胞可见于多种成熟组织(Moore KA，Science，2006.311(5769)：1880-1885)。

例如Thy-1^low或FLK2^-Lineage^-Sca-1⁺c-Kit⁺分选造血干细胞群(Christemsen JL等，PNAS，2001.98：14541-14546；Uchida N等，Experimental hematology，1996.24：649-659)，用CD14⁺免疫磁性分离的方法从外周血筛选新的干细胞群(PCT/055950干细胞的提纯、识别及用途)用α₆^bri 10G7^dim(LiA等，PNAS，1998.95(7)：3902-3907；Tani H等，PNAS，2000.97(20)：10960-10965；Lavker RM等，PNAS，2000.97(25)：13473-13475)识别人类、啮齿动物来源的上皮干细胞，但其有效性还有待进一步证实；

通过小鼠遗传学标志谱系试验等实验，结合所发现的分子标志物，例如Musashi-1、Lgr5等提供了鉴定干细胞的可能(BarkerN等，Nature，2007.449(7165)：1003-1007；Haegebarth A等，Am J Pathol，2009.174(3)：715-721)，然而它们的有效性还有待进一步证实。