[发明专利]一种干涉GDF9基因表达的 siRNA及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学以及生物工程技术领域，具体涉及抑制水牛生长分化因子9（GDF9）基因表达的siRNA片段。 

背景技术

RNAi（RNA interference），即RNA干扰，是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。RNAi是通过双链RNA诱导与之同源的mRNA降解，导致目标基因转录后缄默的现象或机制。此现象于1998年在对线虫的研究中首次发现。siRNA是进入细胞内的外源dsRNA或内源产生的dsRNA，被Dicer酶切割成为2l-23nt长的小分子，这种siRNA是RNAi机制中的关键中间产物，具有非常强的RNAi效应。 

RNAi途径中，RISC（RNA induced silencing complex）的形成发挥了极大的作用。RISC是由小分子RNA(siRNA／miRNA)，Dicer，DadR蛋白和Argonaute家族蛋白组成的复合体，其作用是直接造成与复合体中siRNA高度互补的mRNA被降解。RISC作用过程中，mRNA的切割发生在对应的siRNA 5’端10～11位核苷酸间，切割将mRNA一分为二，切割后mRNA从RISC上释放。完成一次切割后，引导 siRNA仍然结合在RISC中，继续完成更多轮的切割。 

生长分化因子9（growth differentiation factor 9 ，GDF9）主要在卵泡中表达，同时在非性腺组织中有表达，能促进始基卵泡的发育，与FSH协同刺激卵泡生长，主要调控卵泡的生长发育和生殖功能。GDF9基因敲除小鼠因初级卵泡发育受阻，从而影响生殖。而体外给予生物活性的GDF9可诱导窦前卵泡生长和细胞分泌。以上表明GDF9对卵泡的生长发育影响是有阶段依耐性。Hanrahan等(2004)发现GDF9的FecGH突变（G8突变）能显著提高杂合绵羊的排卵率。 

siRNA作为一种新型的基因工具来抑制特定基因的表达，目前大规模应用于生物细胞、组织和个体，特别是用来制备基因敲低模式动物，从动物整体水平研究基因的功能，siRNA的抑制特定基因的优点是其他基因技术都无法比拟的。而对于水牛生长分化因子9的siRNA还未见研究报道。 

发明内容

本发明的目的在于通过下调GDF9基因的部分功能来提高水牛的繁殖率，由于水牛繁殖率普遍较低，本发明提供了一种抑制水牛生长分化因子9（GDF9）基因表达的siRNA。 

本发明通过以下技术方案实现上述目的： 

一种抑制水牛生长分化因子9（GDF9）基因表达的siRNA，分别命名为GDF9-1、GDF9-2和GDF9-3，其核苷酸双链中正义链序列如下：

GDF9-1： SEQ ID NO:1；

GDF9-2： SEQ ID NO:2；

GDF9-3： SEQ ID NO:3。

所述siRNA与GDF9基因mRNA反向互补，其长度为19~27bp。 

含有上述siRNA的shRNA。 

上述shRNA的编码基因，两端带有BamHⅠ和EcoR I酶切位点的序列，便于构建表达质粒，双链核苷酸序列如下： 

GDF9-1dsDNA：正义链具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；

GDF9-2dsDNA：正义链具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；

GDF9-3dsDNA：正义链具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

一种表达载体，由上述shRNA的编码基因与出发载体构建的，即将shRNA编码基因插入出发载体上构建而成。 

慢病毒载体可以直接高效率地感染分裂期和非分裂期细胞，且转染效果更加稳定，作为上述出发载体中的优选方案，其中病毒载体最优选pshRNA-copGFP Lentivector。该载体具有完整的shRNA插入位点以及绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）报告基因，实现了靶基因shRNA的高效表达、病毒包装以及转基因的直观展示。 

本发明的siRNA可以制备成基因药物或其他合适的制剂用于下调水牛生长分化因子9的表达，从而提高水牛的繁殖性能。 

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：