[发明专利]一种基于均相免疫同步荧光检测多个疾病标志物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物、医学、材料、化学、病毒学等学科的交叉学科领域，更具体涉及一种基于荧光染料和氧化石墨烯均相免疫同步荧光检测多个疾病标志物的方法。

背景技术

检测多种疾病标志物或病毒通常采用蛋白质阵列的方法，虽然此方法选择性好，但是操作步骤多，费时费力，成本高，并且不能同时检测不同性质的蛋白或病毒。采用均相免疫反应进行病毒检测以及疾病诊断，具有快速、灵敏、特异等优点，而且可以同时检测不同性质的多种蛋白或病毒。许多由病毒感染导致的疾病征兆很相似，单从并发症状看无法确定到底是由哪一种病毒感染导致的疾病。因此需要简便快速的高通量方法，同时检测多种病毒，并用于临床疾病早期诊断。近年来，荧光分析法以其高灵敏度、快速简便的优势在病毒检测中得到了广泛的应用，然而传统的荧光分析法只能实现单一分析物的检测而无法实现多组分同时检测；为了实现多组分同时检测，申请人开展了同步荧光扫描法研究，建立了一种简便、快速、同步荧光检测多种抗原或病毒的均相免疫检测方法。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供了一种基于荧光染料和氧化石墨烯均相免疫同步荧光检测多个靶分子的方法。采用荧光染料为荧光信号分子，利用同一系列荧光染料斯托克斯位移相近的特点，实现多个荧光标记物同步荧光检测；氧化石墨烯的荧光猝灭效率高，可作为荧光猝灭剂，灵敏度高；荧光染料标记抗体与待测抗原免疫反应进行检测，特异性强。首先将一定量的不同发射波长的带有琥珀酰亚胺酯的荧光染料分别与不同抗体偶联，加入氧化石墨烯后，荧光染料的同步荧光被猝灭；若加入与抗体相对应的不同量的抗原，则荧光猝灭程度不同，这样既可根据不同颜色荧光染料的同步荧光强度变化对抗原进行定性识别，还可以荧光强度变化值对抗原或病毒进行定量检测。

具体地，为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施：

一种基于均相免疫同步荧光检测多个疾病标志物的方法，其步骤如下：

（1）将不同疾病标志物的单克隆抗体分别与不同发射波长的琥珀酰亚胺酯修饰的荧光染料偶联后溶解于溶剂中，配制成偶联物浓度均为1.0×10^-8~1.0×10^-4mol/L的溶液A；

所述琥珀酰亚胺酯修饰的荧光染料为琥珀酰亚胺酯修饰的Alexa Fluor或Cy系列荧光染料；

（2）将氧化石墨烯溶解于溶剂配制成1.0×10^-6~1.0×10^-5mol/L的溶液B；

所述步骤（1）和（2）中的溶剂为水或15mM pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液；

（3）取6μL溶液A与一定量的溶液B混合，然后用水或15mM pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液定容到600μL得溶液C，溶液A和溶液B的比例按偶联物与氧化石墨烯摩尔比1:10~1:20计；

（4）取溶液C 500~1000μL于微量荧光比色皿中，以激发波长280~480nm激发，测量其在发射波长350~700nm处的同步荧光强度；

（5）取6μL溶液A与一定量的溶液B混合，两者的用量关系同步骤（3），加入不同量的待测疾病标志物，用水或15mM pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液定容到600μL后，取样以相同的激发波长激发，测量各自在同一发射波长处的同步荧光强度；

（6）将荧光染料的荧光强度回升值对应于抗原浓度作图，得到定量检测抗原的工作曲线；

（7）在进行实际样品检测时，将处理好的待测溶液进行步骤（5）的操作，以同步荧光强度变化对抗原进行定性识别；或以荧光染料的荧光强度回升值带入工作曲线即可进行定量分析。

本方法用于四种抗原AFP、CEA、CA125和CA199及三种流感病毒H1N1、H5N1和H9N2的定量检测，可在1-15分钟内完成。

本发明方法与现有技术相比，具有以下优点和效果：

与蛋白质阵列分析及芯片技术相比，本方法灵敏度高、简便快速、选择性好、通用性强。将本方法应用于抗原-抗体反应检测，将使现有的标准检测技术发生根本性变革。多种抗原进行同时检测，只要选择不同颜色的荧光染料与抗体偶联再与氧化石墨烯作用，便可以建立一种通用的多种抗原检测新方法。

基于荧光染料和氧化石墨烯均相免疫同步荧光检测，将实现肝癌标志物AFP、CEA、CA125和CA199的同时检测；亦可实现病毒如人体肠道病毒EV71，SARS病毒、禽流感病毒、炭疽病毒、艾滋病病毒、出血热病毒、柯萨奇B3病毒的实时、快速、均相、灵敏及选择性检测。