[发明专利]一种改进的植物花粉管转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术遗传育种领域，具体涉及一种改进的植物花粉管转化方法。

背景技术

1981年，我国的科学家周光宇首次应用花粉管通道法将外源DNA导入陆地棉中，成功培育出抗枯萎病的转基因品种。近年来，花粉管通道法因其独特的优势，被科学家们广泛的利用，进行植株的转基因操作。该方法有以下几个优点：首先，花粉管通道法适用范围较广，可以应用到任何开花的植物中，并且可以在不同物种之间进行不同的基因转移，因此其放宽了目的基因和受体植株的范围。第二，其不依靠繁琐的植物组织培养和诱导植物再生的漫长过程，花粉管通道法利用的是自然的生殖过程，可直接获得转化过的转基因种子，简捷、快速。第三，该方法应用于植株转化时，大大加快了转化速度。对于大多数植株而言，从其开花到转基因种子的收获平均在3-4个月的时间。即在当年即可收获转基因种子，并进行检测。第四，操作简捷，技术易掌握，同时不需要昂贵的设备，因此可以应用于大面积植株的遗传转化。但是该方法在具体的实际应用中，还有一定的缺陷，即该方法转化效率不高，在转化过程中，外源质粒DNA易降解。

DNA保护剂主要是一类可以保护抗原的物质，特别是DNA、RNA不受体内酶的分解。DNA保护剂包括：氢氧化铝明胶、磷酸钙和乳油保护剂。而在医学中，铝盐佐剂是被允许应用于人类的佐剂。利用这类铝盐胶体，抗原会跟一个不溶的凝胶沉淀剂结合，或者经过相互的电作用形成凝胶粒子。该保护剂的作用原理是因其是一个暂时的储存库，缓释是其非常重要的一个功能。它可以将抗原包裹住，可以避免抗原分子被降解，同时可以避免受体内的清除作用而丧失。乳油保护剂一般是用矿物油、稳定剂及乳化剂（如Tween20、Tween80及Span80）按照一定的比例进行混合，然后与抗原混合制成。这类保护剂是一种油包水的乳剂，它可以作为一个保存库，避免抗原被水相中的机体水解，进而到达抗原被保护的目的。而传统的花粉管通道法，大多用1×SSC溶液作为回溶剂，回溶目的基因或质粒。

发明内容

本发明的目的是为解决花粉管通道法在转化过程中，外源质粒DNA易降解，转化效率不高的问题，而提供一种改进的植物花粉管转化方法。

一种改进的植物花粉管转化方法，其特征在于：将外源质粒DNA重悬于质粒DNA保护剂中，制成外源质粒DNA的混合液；浓度为0.8-1.2 μg/μL，然后利用植物花粉管通道法转化到植物中；

所述的外源质粒DNA保护剂，它是氢氧化铝溶胶保护剂、磷酸钙保护剂和Tween20保护剂中的一种；

所述的外源质粒DNA的浓度为1 μg/μL。

所述的外源质粒DNA的混合液是由下述的方法制备的：

（1）在一支玻璃试管中加入2-4mL 1%氯化铝溶液，再加入0.05-2 mL 10%氨水，使其形成沉淀；

（2）弃上清，用蒸馏水清洗沉淀3-5次，采用倾析法除去水分，最后一次用过滤法使洗液与沉淀分离；

（3）将沉淀转入150 mL烧杯中，加入蒸馏水20-80 mL，搅拌并加热煮沸。期间加入0.1-0.2 mL 0.1 mol/L HCl溶液，不断搅拌，即可获得氢氧化铝溶胶；

（4）氢氧化铝溶胶重悬外源质粒DNA。

所述的外源质粒DNA的混合液是由下述的方法制备的：

（1）用灭菌蒸馏水5-15 μL重悬外源质粒DNA，使其浓度为1 μg/μL，再加入50-60 μL 2 mol/L CaCl2溶液混匀；

（2）离心，将上清液取出，加入到400-450 μL灭菌蒸馏水中；得外源质粒DNA-CaCl2溶液；

（3）取一个2 mL灭菌的离心管，向其中加入500 μL， pH6.95-7.05 ，2×HEPES缓冲液，向HEPES缓冲液中以吹气的方式逐滴滴入外源质粒DNA-CaCl2溶液；

（4）将试管放于37℃水浴中孵育3-5 min，可见乳白色混浊出现；

（5）10000 r/min离心3 min，弃上清；所得的混合物即为磷酸钙-外源质粒DNA。

所述的外源质粒DNA的混合液是由下述的方法制备的：

（1）采用灭菌蒸馏水与蔗糖，配成浓度为8%的蔗糖溶液，115℃灭菌15-20 min；

（2）取上述蔗糖溶液与Tween20混合，制成浓度为5%的Tween20保护剂；

（3）取5%的Tween20保护剂10-20 μL外源质粒DNA。