[发明专利]中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及脂质运载蛋白含量检测试剂盒，尤其涉及一种人体内中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)含量的检测试剂盒及其制备方法，本发明进一步涉及该检测试剂盒在检测人体内NGAL含量的使用方法，属于人体内NGAL含量的检测领域。 

背景技术

近年研究发现，脂质运载蛋白家族中的一个新成员——中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)，与急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)及各种原因引起的慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)密切相关，是预测AKI的一个新型标记物，同时也是监测CKD进展和肾功能损害的生物学指标。 

NGAL是脂质运载蛋白家族的成员之一，于1993年由Kjeldsen等在人类中性粒细胞中发现和分离出来，它的大鼠、小鼠种间同源基因分别为α2微球相关蛋白和24p3蛋白。在生物体内NGAL有分子量为25kDa、自身聚合46kDa同源二聚体或与MMP-9聚合形成135kDa异源二聚体三种存在方式。NGAL具有由8条β折叠相互作用而形成的β自折叠桶结构，其底部内侧的疏水核可以结合并转运亲脂性配体，这一结构特点决定了NGAL的生物活性。在β-折叠桶封闭端的β4-β5间有游离的巯基(Cys87)，这为NGAL结合MMP-9前体奠定了结构基础。目前认为NGAL蛋白能运输介导炎症反应的一些亲脂性分子，如血小板活化因子(PAF)、白三烯B4(LTB4)和脂多糖(LPS)等；调节MMP-9活性，并可能参与清除炎症介质，调节免疫反应，抑制细 胞凋亡以及肿瘤的发生发展、浸润转移等过程。NGAL还通过与含铁的铁载体结合，形成NGAL-铁载体-铁复合物，参与肾脏的发生、发展及修复过程。在正常的生理状态下，除了中性粒细胞以外，NGAL在人类很多组织如支气管、胃、小肠、胰腺、肾脏等的上皮细胞中有低水平表达。而在病理状态下，这些组织的上皮细胞则有大量NGAL表达，特别是在损伤的近端肾小管上皮细胞中。 

在寻找AKI早期诊断标记物的研究中，人们发现NGAL是一个很好的预测及诊断指标。有学者在急性缺血再灌注和顺铂诱导的AKI小鼠模型中，发现在损伤发生数小时之内即可检测到NGAL的表达明显增高。美国Cincinnati儿童中心的研究发现，在接受心脏分流术的71例儿童患者中，其中20例术后发生急性肾功能衰竭的患儿术后2h尿NGAL水平即明显升高，而其血肌酐的升高则发生在术后1-3d，提示尿NGAL是缺血性肾损伤的一个早期、敏感指标。后来不少类似的研究均得到同样的结论，即AKI时血、尿NGAL水平均升高，尿NGAL水平升高更为显著。并且NGAL升高较早期肾脏损伤的其他指标如肾脏损伤分子(kidney injury molecular1,KIM-1)、Cyr61(cystein richprotein61)、β2-微球蛋白等出现得要早。同时，NGAL水平与肾脏损伤程度呈正相关，血和尿NGAL可作为诊断AKI早期、敏感、特异性的早期生物学标记物，并在一定程度上可以反映AKI严重程度及判断预后。 

目前NGAL的检测方法有酶联免疫法、放射免疫法、Western-blotting、化学发光法以及胶乳免疫比浊法。酶联免疫法自动化程度不高，且受人为因素影响较大；放射免疫法存在着环境污染问题；Western-blotting操作复杂，测定精密度低；而化学发光法灵敏度虽高，但测定线性范围较小且检测成本较高，需要特定化学发光检测仪，这些原因导致其应用范围较小；胶乳免疫比浊法也是测定人血浆或尿液中NGAL浓度的常用方法，它与上述其他几种方法相比较，存在操作简单、灵敏度高、线性范围宽、无污染、应用范围广等显著的特点。因此，胶乳免疫比浊法有着极大的研究价值， 但是目前市场上的胶乳免疫比浊法检测试剂盒存在着检测不到NGAL/MMP-9复合物、抗干扰能力差、特异性低、试剂稳定性不好或检测线性范围窄等问题，有待改进。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒； 

本发明的目的之二是提供一种制备所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的方法。 

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：