[发明专利]植物绿色组织特异性表达启动子pGreen及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种在植物绿色组织中驱动基因表达的启动子及其应用。

背景技术

随着世界人口的不断增加，人们对农产品的需求也日益增大，作为生命能源供应的粮食尤为重要，如水稻和玉米等。然而在农业生产中，人类赖以生存的粮食和经济作物极易受到虫害的侵袭而减产或使得农产品品质下降甚至产生对人体有毒、有害的物质，造成较大损失。在现代农业中，使用化学杀虫剂是减少虫草害的重要方法。但是，化学杀虫剂的长期、大量使用不仅令生产成本增高，还给生态环境和人畜安全带来一系列危害。

当今，人们对食物安全性和环保性日益重视，减少甚至杜绝化学农药的使用是农业生产的新要求。培育转基因抗虫作物成为一种有效的途径。这种新的技术从1996年开始在世界范围内大规模地应用。目前，世界上应用最为广泛的抗虫基因是Bt（Bacillus thuringiensis）杀虫基因^[1，2]。2010年全球转基因作物种植面积达到1.48亿hm²,占全球耕地总面积的10%，其中39%是转入Bt杀虫基因^[3]。转基因抗虫作物的种植可以大幅度减少杀虫剂的使用量，这不仅大大降低了农民的种植成本，而且对保护人类健康和生态环境都有积极的意义。

随着对转Bt基因作物的进一步的研究和广泛的应用，问题也日益凸显，主要体现在两方面，一是害虫对转基因作物产生抗性；二是转基因作物食用安全性问题，尤其是水稻，它作为全球一半以上人口的口粮，公众对转基因水稻的食用安全性更是存在着顾虑和质疑。目前用于转基因抗虫的Bt杀虫蛋白中Cry(Crystal Protein，Cry)蛋白是目前研究最深入、应用最广泛的Bt杀虫毒素，但目前已发现多种害虫对其产生了抗性^[4-7]；而VIP(Vegetative Insecticidal Protein，VIP)杀虫蛋白是一种与ICPs完全不同的新型杀虫蛋白，对于扩大杀虫谱、延缓害虫抗性都具有深远意义^[8,9]。这些基因资源都已成为构建抗虫农作物新品种的重要武器。但是这些基因在转基因植株中多利用组成型的启动子驱动其表达，这种表达方式由于违背了植物的自然生理活动规律，不仅可能达不到转基因的目的，甚至对转基因植物自身的生理活动造成了极大伤害^[10-12]。

针对以上问题，人们做了诸多研究以延缓昆虫抗性、提高杀虫活性并最大限度地降低转基因作物的安全隐患问题，例如堆叠多种杀虫基因，或使用组织特异性启动子。启动子（promoter）是一段位于结构基因5’端上游调控基因表达的DNA序列，有组成型表达、诱导型表达和组织特异型表达3种类型。组织特异型表达的启动子现在被认为是对目的基因实现高量表达的重要途径，也是培育高效、安全的转基因作物的首选^[13]。

绿色组织特异启动子是高等植物组织特异性启动子中的一种，驱动外源基因在茎叶等绿色组织中特异表达，它既可以用于以茎叶为主要收获产物的作物，使蛋白质产物富集于茎叶中，减少宿主植物无谓的物质能量消耗，改善光合作用特性；也可以用于以种子、果实为主要收获产物的作物，让抗虫、抗除草剂等外源基因只在茎叶部分而不在种子果实等器官中表达，解除人们对转基因作物食品安全性的顾虑^[14]。同时，植物来源的启动子不会造成基因的逃逸。鉴于此，绿色组织特异性启动子在植物基因工程研究中具有广泛的应用前景。

上文中涉及的参考文献具体如下：

[1] Grochulski P, L Masson, S Borisova, M Pusztai-Carey, J L Schwartz, R Brousseau and M Cygler. (1995) Bacillus-Thuringiensis Cry1a(a) Insecticidal Toxin-Crystal-Structure and Channel Formation．J Mol Biol 254(3)：447-464（苏云金芽孢杆菌Cry1a（a）杀虫毒素晶体结构和孔道形成）；

[2] Vaeck M, A Reynaerts, H Hofie, S Jansens, MD Beukeleer, C Dean, M Zabeau, MV Montagu, J Leemans．(1987) Transgenic plants protected from insect attack. Nature 328: 33-37（转基因植物能防止害虫侵害）；