[发明专利]一种纯化恩夫韦肽的方法

说明书

技术领域

本发明属于反相HPLC技术领域，尤其是涉及一种规模化纯化恩夫韦肽的方法。

背景技术

恩夫韦肽是一种人工合成的由36个氨基酸组成的链状多肽。是白色或灰白色非晶型固体，在纯水中几乎不溶，但在PH7.5的缓冲液中溶解度达到82～142g/ml。分子式为C ₂₀₄ H ₃₀1N ₅₁ O ₆₄ 。分子量为4492。其结构式为：CH₃CO-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH₂。

恩夫韦肽为合成肽类HIV融合抑制药，可与病毒包膜糖蛋白结合，阻止病毒与细胞膜融合所必需的构象变化，从而抑制HIV-1的复制。它是近7年来抗艾滋病治疗药的先锋，是第一个融合抑制剂。其它抗艾滋病药物是作用于细胞内部，阻止病毒在细胞内部复制;而这一药物却是通过阻止病毒与T细胞等免疫细胞的接触融合，干扰HIV-1进入T细胞，防止艾滋病患者的免疫系统遭受病毒破坏来发生作用，因此又称为融合抑制剂。

目前涉及关于恩夫韦肽的报道基本都是合成工艺方面，而在纯化工艺上基本没有，因恩夫韦肽的理化性质，在酸性及中性环境中溶解度极低，因此造成其在HPLC上纯化的困难，使其收率极低，本发明通过在碱性环境中使用的色谱条件有效解决了这个问题，从而达到提高收率的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一条适于规模化生产恩夫韦肽的纯化方法，主要解决恩夫韦肽在酸性及中性环境中溶解度极低，因此造成其在HPLC上纯化的困难，使其收率极低的技术问题。本发明使用反相高效液相色谱法纯化恩夫韦肽，并用HPLC转盐法交换转盐，效率高，成本低且收率好，达到产业化的要求，解决现有技术分离得到恩夫韦肽的空白。

 为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种纯化恩夫韦肽的方法，包括如下步骤：

  1）将恩夫韦肽粗品以稀氨水完全溶解后，以滤膜过滤后待用，以固定相为聚合物色谱柱，流动相为两相，磷酸盐缓冲液为A相，色谱乙腈为B相，进行梯度洗脱一次纯化，收集目的峰值含量大于80%的肽溶液；

 2）以固定相为反相硅胶色谱柱进行二次纯化同时转盐，流动相为两相，醋酸水溶液为A相，色谱乙腈为B相，收集目的峰值含量大于98%的肽溶液；

3）将最终的高纯度肽溶液减压旋蒸浓缩冷冻干燥，得粉末状成品肽。

更为优选的方案是：所述聚合物色谱柱是以聚苯乙烯-聚乙烯苯为基质的聚合物树脂填料为固定相的聚合物色谱柱。

更为优选的方案是：所述磷酸盐缓冲液pH为7.5-8.0。

更为优选的方案是：所述步骤1）中梯度洗脱的B相体积百分浓度为30%～50%，检测波长为230nm。

更为优选的方案是：所述二次纯化及转盐所用制备柱为以十八烷基键合硅胶填料为固定相的反相硅胶色谱柱。

更为优选的方案是：所述二次纯化及转盐中醋酸水溶液体积百分浓度为2.0%，梯度洗脱的B相体积百分浓度为5%～20%～25%，检测波长为230nm。

本发明的有益效果是：本发明提出的一条适于规模化生产恩夫韦肽的纯化工艺方法，先以聚合物制备柱在碱性条件下进行一次纯化得到纯度80%以上的产品，再以C18填料的制备柱进行二次纯化同时转盐，不仅能得到HPLC纯度大于98.0%的精肽，还有效地提高了产品的收率，降低了成本，同时生产方法简单，易于操作，从而达到大规模工业化生产的目的。

具体实施方式

实施例1

1．样品处理：称取2g恩夫韦肽粗品于烧杯中，边加入体积百分浓度为5%稀氨水边超声至液体澄清，用孔径为0.45um滤膜过滤后收集滤液备用。

2．一次纯化

纯化条件：色谱柱：以固定相为聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的聚合物树脂填料的聚合物色谱柱，柱子直径和长度为：3cm×25cm.流动相：A相：20mmol/l磷酸氢二钠水溶液，以氨水调pH为7.5-8.0；B相：色谱乙腈。流速：15-20ml/min。检测波长：230nm。梯度：B相体积百分浓度为：30-50%，30-50min。进样量为2.0-2.5g。