[发明专利]一种鼠李糖脂作为细胞低温或超低温保存的保护剂应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物表面活性剂技术领域，尤其涉及一种鼠李糖脂作为细胞低温和超低温保存保护剂的应用。 

背景技术

生物表面活性剂是一种具有复杂结构和多样化基团的表面活性物质，其主要由微生物产生。生物表面活性剂在环境保护、医药化工、食品以及农业等各领域相比于化学表面活性剂更受青睐，因为其具有易被降解且本身无毒等特点，使其具有较大的环境友好性及生物相容性。生物表面活性剂还因为其相对特殊的结构而使其具有一般化学表面活性剂未能体现的作用。由亲水的1-2个鼠李糖与亲脂的1-2个脂肪酸链连接构成的鼠李糖脂是目前研究最为广泛的生物表面活性剂。其研究遍及采油、环境生物修复、化妆品、食品及医药等多个领域，最近还见报道因其独特结构而具有特异性杀死癌细胞的作用。 

活的动物细胞在组织工程，细胞移植和基因工程领域都是极为重要的研究和治疗工具，但是因为来源有限限制了其应用。活细胞保存技术可以有效促进其实际临床应用。活细胞主要是采用液氮进行超低温冷冻或者温度处于0-4度的低温保存，此技术也适合于组织、器官的保存。目前，新的保护剂诸如海藻糖等被用于细胞冻存或者低温保存，但是还都存在保存效果不佳、保存条件要求苛刻和操作较为复杂等问题。 

虽然鼠李糖脂具有潜在的广泛用途，但未出现作为细胞低温或超低温保存的保护剂的应用报道。本发明采用环境、友好的生物表面活性剂鼠李糖脂，用于细胞的低温或超低温保存。 

发明内容

本发明的目的在于针对海藻糖作用不显著的缺陷，提供一种鼠李糖脂在细胞低温或超低温保存中的作用。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种鼠李糖脂作为细胞低温或超低温保存的保护剂应用，将鼠李糖脂与海藻糖一起添加到细胞低温或超低温保护剂中，作用于活细胞，使细胞维持较高的活率和极好的功能；所述鼠李糖脂的质量百分比浓度高于90%，鼠李糖脂的用量为5-100mg/L，海藻糖的用量为0.1-1M。 

本发明具有的有益效果是：本发明所提出的鼠李糖脂作为超低温或低温保 护剂，可显著提高细胞的存活率和功能。 

具体实施方式

鼠李糖脂的使用方法见如下步骤： 

1.所用的鼠李糖脂具有高于90%以上的纯度（质量百分比浓度）。 

2.细胞的低温保存：细胞先在37℃预培养12-18小时后，被转移至0-4℃进行低温培养24-36小时，其中低温培养过程中培养基添加了0.1-1M海藻糖和5-100mg/L的鼠李糖脂。低温保存结束后，将细胞复温至37℃，并进行培养，观察细胞活率及功能。 

3.细胞的冻存:由冻存培养液再添加0.1-1M海藻糖和5-100mg/L鼠李糖脂组成细胞冻存液，将待冻存的细胞加入到上述的细胞冻存液中，然后迅速转移到程序降温盒中，最后将冷冻管转移至液氮中保存。细胞复温后进行活率测定并通过培养测定细胞功能。 

下面结合具体实施例详述本发明具体内容及其所带来的显著效果。 

实施例1、大鼠肝细胞冻存中使用鼠李糖脂 

大鼠肝细胞作为哺乳动物细胞具有体积大、易敏感的特点，因而冻存难度较大。对自行分离得到的大鼠肝细胞采用冻存的方法。为了考察鼠李糖脂和海藻糖联用的作用，细胞冻存采用了三种保护剂配方。 

配方1：1640低碳培养基70%，DMSO 10%，FBS 20%，再添加580μM甘草酸二铵,2mM维生素E，0.1M海藻糖和不同浓度的鼠李糖脂。 

配方2：1640低碳培养基70%，DMSO 10%，FBS 20%，再添加580μM甘草酸二铵,2mM维生素E，1M海藻糖和不同浓度的鼠李糖脂。 

配方3：1640低碳培养基70%，DMSO 10%，FBS 20%，再添加0.1M海藻糖和不同浓度的鼠李糖脂。 

细胞冻存一段时间后水浴复温，用台盼蓝染色的方法测定细胞活率,结果见表1. 

表1：鼠李糖脂对大鼠肝细胞冻存后活率的影响 

从以上结果可以看出，冻存液的组成对鼠李糖脂的作用没有明显影响，鼠李糖脂的加入都可以显著提高细胞的活率，特别是较低浓度（10mg/L）的鼠李糖脂就可以产生较为显著的效果。细胞复温后铺板培养24和120小时候进行形态观察,加入了鼠李糖脂的细胞能够形成更多更大的岛状结构，而且细胞形态也更为立体。 

实施例2：鼠李糖脂对大鼠肝细胞冻存后的肝细胞功能的影响