[发明专利]百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法

权利要求书

1.一种百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法，为对百子莲胚性愈伤组织进行低温-高渗预处理后，依次置于装载液和玻璃化溶液中进行脱水处理，最后将脱水处理后的胚性愈伤组织重新加入新的玻璃化溶液并迅速投入液氮中进行保存。

2.如权利要求1所述的超低温保存方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）低温-高渗预处理：将百子莲胚性愈伤组织置于预处理培养基中，4℃培养；

2）脱水处理：将步骤1）预处理后的百子莲胚性愈伤组织置于装载液内脱水处理后，吸除表面的装载液，再置于玻璃化溶液中，于0℃进一步脱水处理；

3）液氮保存：除去步骤2）进一步脱水处理所使用的玻璃化溶液，重新添加新的玻璃化溶液后，迅速转入液氮中进行保存。

3.如权利要求2所述的超低温保存方法，其特征在于，步骤1）所述百子莲胚性愈伤组织为继代培养20d，易碎、松散的百子莲胚性愈伤组织。

4.如权利要求3所述的超低温保存方法，其特征在于，所述继代培养的培养基为含有1～1.5mg/L毒莠定的MS固体培养基。

5.如权利要求2所述的超低温保存方法，其特征在于，步骤1）所述预处理培养基是蔗糖含量为0.3～0.7M的MS固体培养基；预处理的培养时间为1～5d。

6.如权利要求1或2任一权利要求所述的超低温保存方法，其特征在于，所述装载液为含有2M丙三醇、0.4M蔗糖、10mM KNO₃的MS培养液；所述玻璃化溶液为含有30wt%丙三醇、15wt%乙二醇、15wt%二甲基亚砜、0.4M蔗糖的MS培养液。

7.如权利要求1或2任一权利要求所述的超低温保存方法，其特征在于，装载液脱水处理的时间为20～80min，玻璃化溶液脱水处理的时间为20～80min。

8.一种针对权利要求1-7任一权利要求所述百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法的解冻及再培养方法，为将玻璃化超低温保存的百子莲胚性愈伤组织从液氮中取出，置于35～40℃水浴中快速解冻，然后用洗涤液洗涤，再吸干表面的洗涤液，最后转入恢复培养基中进行恢复培养。

9.如权利要求8所述的解冻及再培养方法，其特征在于，所述洗涤液为含有1.2M蔗糖和10mM KNO₃的MS培养液。

10.如权利要求8所述的解冻及再培养方法，其特征在于，所述恢复培养基为含有1～1.5mg/L毒莠定的MS固体培养基，所述恢复培养的条件为黑暗环境，恢复培养的温度为23～27℃。